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前不久，甄博分享了一篇中草药提取物发了Nature Aging的文章（中草药提取物携“细胞衰老”登上Nature Aging！老外都开始研究中药了，你还在等什么？），看的出了这类文章的关注度还是很高的。植物提取物（天然产物）目前的研究热度很高，不仅是咱们国人团队在发，国外团队也是高分频出。

今天甄博带来的这篇文章是由自成都中医药大学和德国约翰古腾堡大学联合发表的。研究揭示了芍药苷通过调节MAPK/mTOR信号通路激活自噬、抑制氧化应激和凋亡来保护肝细胞。不仅为药物性肝损伤的治疗提供了新的视角，也为芍药苷作为潜在治疗药物的进一步研究和开发奠定了基础。设计思路经典好用，非常适合急需申请课题的你~

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题目：芍药苷通过MAPK/mTOR信号通路启动自噬，保护肝细胞免受APAP诱导的损伤

杂志：Cellular & Molecular Biology Letters（IF 9.2）

发表时间：2024.9

研究背景    

药物性肝损伤（DILI）正逐渐成为引起急性肝衰竭的全球性普遍问题，尤其是对乙酰氨基酚（APAP）引起的急性肝损害。芍药苷（Paeoniflorin，PF）对多种肝脏疾病具有广泛的治疗作用。然而，在目前的研究中，它们之间的关系仍然很少被研究。该研究旨在探讨PF对APAP诱导的肝损伤的保护作用，并研究其可能的分子机制。

研究思路

C57BL/6J雄性小鼠注射APAP建立DILI模型，并连续5天给予PF治疗。为了阐明PF在APAP诱导的DILI中的药理作用，采用高通量等技术对其分子机制进行了研究。    

研究结果

PF可减轻APAP所致肝损伤的病理改变

通过宏观病理检查，观察到注射APAP后，APAP小鼠的体重开始较对照组下降，肝脏指数和脾脏指数均升高。相比之下，高剂量PF和低剂量PF组可以使脾脏和肝脏肿胀降低，说明PF减轻了脾脏和肝脏的肿胀。    

与对照组相比，APAP组大鼠血清中肝功指标均显著升高，表明DILI模型建立成功。与APAP组相比，高、中剂量PF显著降低了ALT、ALP、γ-GT、TBIL和AST水平。

此外，病理结果也显示了PF对肝脏具有保护作用，明显减缓了APAP引起的肝损伤的进一步进展。

PF抑制ROS，提高APAP模型小鼠抗氧化能力

为了阐明PF处理对氧化状态的影响，首先评估了氧化相关指标的水平。与对照组相比，经APAP处理后，SOD和GSH的含量显著降低，而PF在不同浓度下，尤其是在200 mg/kg时，恢复了APAP小鼠的抗氧化能力。对于MDA，不同剂量的PF减轻了APAP组的明显升高和氧化效应的发生。这些指标表明，PF减轻了APAP模型氧化应激的发生。    

同时，用免疫荧光法观察和测定ROS的表达。与APAP组相比，MPF和HPF组的ROS荧光表达明显受阻，说明高、中剂量PF显著抑制了肝细胞中ROS的表达。APAP组CYP2E1阳性表达水平高于对照组和PF组。APAP组CYP2E1反应明显加重。然而，与APAP组相比，给予100和200 mg/kg剂量的PF明显逆转了APAP刺激的氧化应激。APAP注射后CYP3A4的表达增加，而200 mg/kg剂量的PF明显逆转了这种作用。TEM结果显示，APAP组线粒体结构模糊，脊线不清晰。基质电子密度增大，粗内质网扩大。高剂量PF处理后，线粒体结构完整，基质均匀，电镜下呈均匀的灰色结构。粗面内质网的形态结构得到恢复。这一证据解释了PF阻断ROS的产生，提高细胞色素P450酶的活性，增强小鼠抗APAP损伤的抗氧化能力。    

PF抑制APAP诱导的肝损伤中细胞凋亡的进展

与对照组相比，APAP组肝损伤区有大量阳性凋亡因子聚集。此外，与APAP组相比，治疗组细胞凋亡阳性表达率明显降低，提示PF改善了APAP诱导的肝损伤细胞凋亡。为了进一步证实凋亡在PF治疗肝损伤中的作用，采用免疫组化方法检测凋亡特征因子的阳性表达。阳性表达集中在肝门静脉区，且APAP刺激小鼠肝脏中caspase 3的表达更为严重，提示肝损伤过程伴有细胞凋亡。同样，caspase 9在对照组低表达，在APAP组高表达。PF预处理降低了促凋亡蛋白（caspase 9和caspase 3）的阳性表达。Western blotting检测促/抗凋亡蛋白（BAD、BAX、caspase 9、caspase 3和BCL-2）的相对表达量。APAP使结果升高，而PF使结果的相对表达明显降低。    

PF激活自噬可保护肝脏免受APAP损伤

相关研究表明，自噬选择性地去除受损的线粒体和NAPQI蛋白加合物，从而阻断APAP引起的肝损伤的进展。用透射电镜观察肝组织中自噬体数量和细胞器结构。与其他各组相比，APAP组粗面内质网广泛肿胀，仅见少量自噬体。同时观察到肝细胞凋亡、核收缩和染色质浓度的变化。相对而言，PF组的自噬体数量明显增强，肝细胞形态结构完整，染色质分布均匀。

利用免疫组化和WB观察自噬调节相关蛋白（LC3和p62）的变化。免疫组化结果显示，PF增加了LC3的阳性表达，对自噬起促进作用。APAP组p62的表达显著增加，而PF处理则减轻了p62的表达。与免疫组化相似，WB对MPF和HPF组p62的表达有明显抑制作用。对于LC3， APAP明显降低了II型与I型的比例， PF有效缓解了这一过程。    

此外，免疫荧光结果显示，APAP组荧光弱，MPF和HPF组荧光强。WB结果表明，APAP组与对照组相比，ATG5和ATG7均减少。相反，PF逆转了APAP的作用，促进了它们的表达。作者还测量了mRNA的表达水平，以确定APAP诱导小鼠自噬活性的变化。这些结果表明，PF有效地缓解了APAP引起的自噬抑制。    

转录组学揭示了PF在APAP诱导的肝损伤中的深层机制

对小鼠肝脏样本进行了测序，以进一步了解PF对APAP所致肝损伤的潜在机制。与对照组不同，APAP组有2444个基因上调，1552个基因下调。HPF组和APAP组共存在508个不同的基因，其中443个下调，65个上调。结合GO分析和KEGG富集结果，MAPK通路在三组差异基因分析中得分较高。因此，转录组学分析结果表明，MAPK信号通路在PF对APAP药物性肝损伤的活性中发挥了关键作用，从而进一步调节mTOR信号，激活自噬，抑制氧化应激和细胞凋亡。    

PF通过直接靶向p38阻断MAPK/mTOR信号通路

为了进一步研究PF在MAPK信号传导中的作用，作者进行了分子对接分析。随后，通过分子动力学模拟研究了PF与p38的结合能力。结果表明p38-PF复合物结合良好。这些结果表明，在MAPK信号级联中，PF可能靶向p38而不是ERK，并且PF与p38的结合是稳定的。    

此外，mRNA表达结果与转录组分析一致。PF（200 mg/kg）显著下调MAPK1、MAPK14和mTOR的相对表达。western blotting结果显示，过量注射APAP后，p38和ERK蛋白的磷酸化被显著激活，MPF和HPF有效抑制了这一变化。而对于mTOR的磷酸化，仅在200 mg/kg PF浓度下才有抑制作用。这表明PF作用于MAPK信号，进而调控mTOR的磷酸化。此外，APAP刺激会抑制ULK1的磷酸化，而PF明显逆转了这一作用，恢复了ULK1的磷酸化，进一步激活了下游自噬蛋白。总之，结果表明PF通过阻断MAPK/mTOR信号传导来启动自噬，保护肝细胞。    

文章小结

文章结合了生化分析、组织病理学、免疫组化、转录组测序等多种实验方法，全面评估了PF对APAP诱导的肝损伤的影响。PF抑制了APAP诱导的肝损伤的关键过程，从而发挥了恢复作用，其保护作用是通过靶向p38下调MAPK/mTOR信号通路来诱导自噬、抑制细胞凋亡和氧化应激。甄博这里还有很多与国自然有关的高分思路和精巧的研究设计，新颖又踏实，还等什么，赶快来找甄博领取吧！