铁死亡又登上Adv Sci！哈医大团队这次做的是“天然化合物靶向ACSL4/FTH1依赖性铁死亡途径”，干湿结合值得学习~

是不是有很多小伙伴会觉得铁死亡这个热点已经流行太久了，想设计个高分思路挺难的？其实并没有！

今天甄博带来的这篇来自哈尔滨医科大学张毛毛/鄂明艳/刘明阳团队的文章，结合了目前研究比较热的天然化合物（原苏木素A），照样登上了Advanced Science （IF 14.3）。这篇文章结合细胞实验、动物实验、RNA测序、蛋白质组微阵列、分子对接和动态模拟等揭示了原苏木素A通过靶向ACSL4/FTH1轴依赖的铁死亡来减轻DOX诱导的心肌损伤和心脏功能障碍的新机制。具体的设计思路跟甄博一起看看吧~

Ps：甄博最近分享了多篇天然化合物相关的高分思路，对这方面感兴趣的宝子可以作为参考哦！想做方案设计和生信数据分析的朋友直接滴滴甄博，如果有方案未敲定我们也可提供评估哦~

云服务器租赁

个性化生信分析定制

课题设计、标书评估

加好友备注“66”领取试用

题目：原苏木素A通过靶向ACSL4/FTH1轴依赖性铁死亡保护DOX诱导的心肌损伤和心功能障碍

杂志：Advanced Science （IF 14.3）    

发表时间：2024.9

研究背景

阿霉素（DOX）是一种有效的抗癌药物，但其临床应用受到剂量依赖性心脏毒性的限制，部分原因是心肌细胞铁凋亡。然而，开发抗铁死亡的心脏保护药物的进展遇到了障碍。原苏木素A（PrA）是一种从苏木精中提取的抗炎化合物，显示出对抗DOX诱导的心肌病（DIC）的潜力。因此，该研究旨在探讨PrA对DIC的影响及其机制，重点关注铁死亡垂。

研究思路

研究结果

PrA减轻DOX诱导的心肌损伤和心功能障碍    

为了研究PrA在DOX诱导的心脏毒性中的作用，按照描述建立了DIC小鼠模型，并在指定的天数内用PrA或DXZ（右雷佐生）处理。与DXZ类似，PrA以剂量依赖性的方式显著提高了DOX处理小鼠的存活率。超声心动图评估显示，与对照组相比，DIC小鼠心功能明显下降，用DXZ或增加剂量的PrA治疗后，心功能部分恢复，表明对DOX诱导的心功能障碍有保护作用。此外，作者通过分析心肌损伤生物标志物和心脏组织病理学变化来评估PrA对DOX诱导的心肌损伤的影响。数据表明，PrA可减轻DOX诱导的心脏损伤并预防心功能障碍。

PrA抑制DOX诱导的心肌铁死亡

为了揭示PrA对DIC保护作用的分子机制，研究人员对三组小鼠心脏进行了RNA测序：对照组、DOX组和DOX联合PrA处理组。差异表达基因（DEGs）的KEGG分析显示（图2B），与对照组相比，DOX这些DEGS中，铁死亡途径是排名最高的富集。相反，PrA处理显著降低了DOX诱导的铁死亡相关DEGs富集。此外，基因集富集分析（GSEA）证实，铁死亡被DOX上调，而被PrA下调，这表明PrA可能通过抑制铁下垂来预防DIC。

为了验证RNA测序数据，作者评估了PrA对DIC小鼠铁死亡的影响。采用PCR分析小鼠心脏中铁死亡标记物Ptsg2的表达。PrA剂量依赖性地逆转了DOX诱导的Ptsg2基因表达。随后，评估了小鼠心脏中与铁死亡相关的必需调节蛋白的丰度，包括GPX4、ACSL4和FTH1。结果显示，DIC小鼠心脏中ACSL4的含量高于对照组，而FTH1和GPX4的含量则低于对照组。在小鼠中，给药PrA逆转了DOX介导的这些蛋白水平的改变。免疫荧光进一步支持免疫印迹的发现。

鉴于铁超载、脂质过氧化和ROS积累是铁死亡的关键特征，进一步检测了上述条件小鼠中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）的水平。与对照组相比，DIC小鼠心肌GSH水平降低，心肌和血清MDA水平升高。相反，PrA逆转了DOX诱导的MDA和GSH水平的变化。此外，DOX给药后，心脏组织中总铁和ROS水平显著升高，PrA治疗消除了DOX诱导的这些结果。综上所述， PrA负调控DIC小鼠的心脏铁死亡。    

PrA减轻DOX诱导的心肌细胞凋亡并维持线粒体功能

作者在体外探讨了PrA对大鼠H9c2细胞铁凋亡的细胞保护机制。H9C2细胞用不同浓度的DOX培养24小时，导致细胞活力显著降低。根据上述细胞活力结果，选择了1 × 10−6 m DOX和50 × 10−6 m的浓度，以及100 × 10−6 m的PrA进行后续实验。根据CCK8和碘化丙啶（PI）荧光染色的结果，PrA在体外显示出剂量依赖性地减少DOX诱导的心肌细胞损伤，显示出细胞保护作用。与体内结果一致，PrA治疗逆转了DOX条件心肌细胞中铁死亡相关参数的水平，包括Ptgs2基因、GPX4、ACSL4和FTH1蛋白、脂质和细胞内ROS水平、细胞内铁离子（Fe²⁺）含量。脂质过氧化产物MDA和GSH。这些结果表明，PrA有效地降低了DOX处理的心肌细胞对铁下垂的体外敏感性。    

线粒体依赖的铁积累和脂质过氧化是DOX诱导的铁死亡的关键因素。作者进一步监测了反映线粒体功能的关键指标，包括线粒体膜电位（ΔΨm）和线粒体衍生ROS （mitoROS）的产生。与对照组相比，DOX处理的心肌细胞ΔΨm减少，线粒体超氧化物积累增加。相反，PrA干预逆转了DOX诱导的这些变化。电镜观察了线粒体的结构和形态特征。DOX暴露导致线粒体收缩和线粒体膜密度增加，而PrA处理以剂量依赖的方式改善了小鼠心脏组织中DOX介导的异常特征。这些结果表明，PrA对DOX诱导的线粒体依赖性铁死亡具有保护作用。    

ACSL4和FTH1被确定为PrA的直接结合靶点

为了确定PrA抑制DOX介导的心肌细胞铁死亡的潜在机制，生物素标记的PrA与Cy5 -共轭链亲和素（Cy5 - SA）串联使用，通过检测PrA与HuProt人蛋白芯片上制备的重组蛋白的结合来识别PrA的潜在靶点。KEGG分析显示，铁死亡相关途径在PrA结合蛋白中富集。考虑到PrA在DOX介导的铁死亡中的重要作用，作者从Z - score中选出参与铁死亡途径的前两个蛋白（ACSL4和FTH1）进行进一步分析。

为了验证PrA是否在细胞裂解物中与ACSL4和FTH1结合，作者将Bio - PrA应用于链亲和素琼脂糖珠上，并与H9c2细胞裂解物共孵育。下拉实验表明，在H9c2细胞的裂解物中，Bio‐PrA与ACSL4和FTH1蛋白结合。随后，进行了分子对接和动力学模拟，以研究PrA如何与ACSL4和FTH1相互作用，并进行了细胞热移测定（CETSA）进行验证。综上所述，PrA直接结合ACSL4和FTH1。    

PrA通过阻止ACSL4磷酸化和激活抑制DOX诱导的铁死亡    

最近的证据表明，Thr328磷酸化是ACSL4酶激活增强铁死亡敏感性所必需的。考虑到PrA直接与ACSL4结合并抑制DOX诱导的铁死亡，作者研究了PrA是否通过干扰ACSL4的酶激活来保护DOX诱导的铁死亡。Western blotting显示，DOX处理小鼠心脏组织中ACSL4磷酸化和蛋白水平均上调，PrA处理以剂量依赖性方式逆转了这些变化。随着时间的推移，DOX条件下的H9c2细胞中ACSL4蛋白和Thr328磷酸化水平逐渐升高。DOX暴露24小时后，高剂量PrA处理的H9c2细胞中ACSL4蛋白和Thr328磷酸化水平也受到抑制。值得注意的是，PrA预处理也降低了DOX条件下H9c2细胞中ACSL4蛋白水平和Thr328磷酸化水平。此外，单独使用PrA治疗不会影响小鼠心脏组织或来自对照组的H9c2细胞中的ACSL4蛋白或Thr328磷酸化水平。因此，PrA与ACSL4的结合在DOX存在下扰乱了ACSL4 Thr328位点的磷酸化及其蛋白表达。

ACSL4介导的PUFA代谢促进了花生四烯酸(AA) -含磷脂的合成和脂质过氧化，最终导致铁下垂。因此，作者测量了在DOX存在的情况下，用或不用PrA处理的H9c2细胞中的AA水平。酶联免疫吸附试验证实，单独进行PrA预处理对AA的产生没有影响；然而，它逆转了H9c2细胞上清中DOX介导的AA生成。尽管暴露于DOX后，高剂量PrA仍保留了其挽救DOX引起的AA积累的能力。基于这些结果，得出结论，PrA与ACSL4结合抑制DOX诱导的ACSL4磷酸化和酶活性，进一步破坏PUFAs的下游代谢和脂质过氧化。

为了证实PrA是否通过阻止ACSL4的磷酸化和激活来抑制DOX诱导的铁死亡，在上述条件下，作者在转染siRNA或特异性靶向ACSL4的过表达质粒的H9c2细胞中评估Ptgs2 mRNA水平。与PrA给药的数据一致，沉默ACSL4抑制DOX条件下H9c2细胞中Ptgs2 mRNA水平，表明ACSL4敲低对DOX诱导的心肌细胞铁死亡有抑制作用。此外，ACSL4-siRNA和PrA对DOX诱导的铁死亡的抑制作用与ACSL4 Thr328磷酸化的降低有关。相比之下，在DOX暴露的H9c2细胞中，ACSL4过表达促进了Ptgs2 mRNA表达和ACSL4 Thr328磷酸化水平。在ACSL4饱和条件下，PrA对H9c2细胞中DOX介导的Ptgs2 mRNA、ACSL4蛋白和Thr328磷酸化以及脂质和细胞内ROS水平的修复能力降低。流式细胞术显示ACSL4过表达削弱了PrA对DOX诱导的心肌细胞死亡的保护作用。综上所述，数据表明，PrA通过阻止DOX诱导的ACSL4 Thr328磷酸化及其随后的激活来抑制心肌细胞铁凋亡。    

PrA通过减少溶酶体中FTH1的自噬降解来防止DOX介导的铁死亡    

数据显示，PrA可以直接与FTH1结合，并恢复DOX诱导的H9c2细胞中FTH1蛋白水平和胞内Fe²⁺生成的改变。因此，推测PrA可能会破坏DOX介导的NCOA4-FTH1相互作用，并随后通过与FTH1结合来干扰铁蛋白自噬。为了验证这一可能性，首先使用western blotting分析了使用或不使用PrA处理的DIC小鼠心脏中FTH1、NCOA4和自噬标志物LC3‐II/I的蛋白表达。与对照组小鼠相比，DOX处理的小鼠心脏组织中FTH1和NCOA4表达较低，LC3‐II/I百分比较高，而PrA干预逆转了这些变化。Co -免疫沉淀实验进一步表明，在DOX -处理的小鼠中，给药PrA削弱了FTH1和NCOA4之间的相互作用。与体内结果一致，PrA恢复了H9c2细胞中FTH1蛋白水平，而不是DOX引起的mRNA表达，这表明在DOX存在下，PrA通过抑制蛋白质降解而不是上调基因转录来调节FTH1蛋白水平。同样，在DOX暴露前后，PrA挽救了H9c2细胞中NCOA4和LC3‐II/I百分比的蛋白表达，以及NCOA4‐FTH1相互作用，而单独使用PrA处理对这些指标没有影响。因此，以上数据支持了PrA和FTH1联合抑制DOX触发的NCOA4 - FTH1内部相互作用和FTH1蛋白自噬降解的结论。

为了阐明PrA预防DOX诱导的铁死亡的机制，使用特异性荧光探针追踪Fe²⁺和溶酶体，评估了细胞内Fe2+的含量和亚细胞位置。总的来说，PrA和FTH1的结合破坏了NCOA4 - FTH1的相互作用，抑制了铁蛋白自噬和溶酶体的Fe2+释放，从而改善了DOX诱导的心肌细胞铁死亡。    

PrA介导的铁死亡抑制可减轻缺血再灌注诱导的心脏损伤和功能障碍

最近的研究表明，铁死亡与心肌I/R之间存在很强的相关性，因此，作者测试了PrA治疗是否对心肌I/R损伤有治疗作用。建立心肌I/R小鼠模型，并给予或不给予PrA治疗指定天数。与I/R小鼠相比，PrA治疗部分恢复了I/R诱导的血清心肌损伤标志物活性升高，梗死面积明显小于I/R组。组织学染色显示，PrA显著改善了I/R‐诱导的心脏纤维化（图7J）。    

为了阐明PrA对心肌I/R损伤中铁死亡的保护机制，采用PCR方法检测了I/R小鼠心脏中Ptsg2的mRNA水平。正如预期的那样，在PrA处理的I/R小鼠中，Ptgs2 mRNA水平显著下调。此外，I/R组心脏和血清MDA水平高于PrA治疗组。PrA处理恢复了I/R‐诱导的小鼠心脏组织中GPX4、ACSL4和FTH1蛋白、铁和ROS含量的变化。研究结果表明，PrA对心肌I/R损伤具有抗心肌收缩和心脏保护作用。

文章小结

研究首次揭示了PrA通过抑制ACSL4/FTH1依赖性铁死亡途径减轻DOX诱导的心肌损伤。此外，在心肌I/R模型中阐明了PrA的心脏保护作用和抗铁死亡作用。总的来说，PrA可以作为一种新的铁死亡靶向抑制剂，在DIC和其他铁死亡介导的疾病的潜在治疗途径中具有很大的进展和转化价值。    

这篇文章用国自然热点加持的研究思路和多维度的研究方法给大家提供了高分文章的范例！如果你也想有耀眼的成果，但暂时缺乏大胆创新的研究思路，那就来咨询甄博吧，这里有超多适合你的高分思路哦！