巨泡式死亡——新热点一定不能放过！厦大团队：新型细胞死亡联合焦亡+凋亡+溶酶体，多热的联合发AS!

新热点甄博一定不会放过，今天带来的这个“巨泡式死亡”是甄博第一次分享，相信也会有小伙伴第一次听说。废话不多说，咱们先看看什么是巨泡式死亡？

巨泡式死亡(methuosis)是近年来发现的一种非凋亡细胞死亡的新形式，在这种细胞死亡过程中,由于过度刺激导致细胞内水泡吸收、积累、融合而逐步形成相对于细胞本身而言的大量巨大液泡,最终导致细胞代谢活动减少、细胞膜破裂、细胞死亡。

细胞死亡的热度已无需甄博多言了，甄博今天带来的这篇文章是厦门大学团队近期发表在Advanced Sciences上的Methuosis Inducer SGI-1027 Cooperates with Everolimus to Promote Apoptosis and Pyroptosis by Triggering Lysosomal Membrane Permeability in Renal Cancer。团队首次发现并证明了DNA甲基转移酶1（DNMT1）抑制剂SGI-1027能够在肾癌细胞中诱导细胞空泡化和巨泡式死亡，而且SGI-1027与mTOR抑制剂依维莫司联合使用能够抑制肾癌细胞的生长、迁移和侵袭，其机制涉及溶酶体膜通透性（LMP）增加，触发细胞凋亡和GSDME依赖的焦亡。文章多热点整合，干湿结合，设计思路非常值得学习~ps：你的硕博课题想好了么？明年的国自然申请启动了吗？很多单位要求11月中旬完成初稿，还有不到一个月的时间大家需要抓紧时间啦！有需要记得联系甄博哦~ 

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题目：巨泡式死亡诱导剂SGI-1027与依维莫司协同作用，通过触发肾癌溶酶体膜通透性促进细胞凋亡和焦亡

杂志：Advanced Sciences

发表时间：2024.10

研究背景

mTOR抑制剂依维莫司已被批准作为肾细胞癌（RCC）的序贯或二线治疗药物。然而，耐药的发展限制了其临床应用。本研究旨在解决依维莫司耐药的挑战，并为晚期RCC的治疗提供新的见解。

研究结果

SGI‐1027通过巨胞饮作用诱导肾癌细胞形成液泡

最初，作者评估了SGI‐1027对肾癌细胞（786‐O, A‐498,Caki‐1）和HK‐2近端小管上皮细胞的细胞毒性。SGI‐1027以剂量依赖性的方式抑制了所有测试细胞系的细胞活力。除了其细胞毒性作用外，SGI‐1027还显示出在肾癌细胞中诱导空泡化的能力。为了确定SGI‐1027诱导的细胞质空泡的来源，使用荧光示踪剂对786‐O和A‐498细胞的溶酶体、线粒体和内质网进行了活细胞染色。SGI-1027诱导的液泡没有与任何测试的示踪剂共定位，表明液泡不是来自溶酶体、线粒体或内质网。由于液泡的形成是巨胞饮的特征之一，作者使用液相示踪剂Lucifer Yellow和靶向晚期核内体标记物Rab7的免疫荧光研究了SGI-1027诱导的液泡是否来源于巨胞饮。在液泡中发现了Lucifer Yellow和Rab7的荧光积累，表明液泡可能源于巨胞饮。然而，液泡没有与溶酶体标记物LAMP1和LAMP2共定位（，表明它们不能与溶酶体融合。    

SGI‐1027‐诱导的肾癌细胞毒性涉及巨泡式死亡

为了研究巨泡式死亡是否与SGI‐1027的细胞毒性有关，作者用透射电镜观察了SGI‐1027处理的786‐O细胞的超微结构变化。SGI‐1027处理导致细胞内由单一膜包围的大量液泡积聚。接下来测试了SGI‐1027诱导的空泡化是否可以通过这些途径的抑制剂来阻止。结果表明，空泡化的形成不依赖于细胞凋亡、自噬或坏死，因为它不能被细胞凋亡抑制剂ZVAD‐FMK、自噬抑制剂3‐甲基腺嘌呤（3‐MA）和necroptosis抑制剂necrostatin‐1阻止。    

为了在空泡化诱导浓度范围内探讨细胞凋亡与SGI‐1027之间的关系，作者检测了SGI‐1027诱导PARP分裂的能力及其对786‐O和A‐498细胞凋亡率的影响。与CDDP相比，SGI‐1027几乎没有诱导PARP的裂解。同样，坏死性抑制素‐1也不能阻止SGI‐1027的细胞毒性，这就排除了SGI‐1027是坏死性坏死诱导剂的可能性。随后，探讨了SGI‐1027与自噬之间的关系。结果表明SGI‐1027破坏了肾癌细胞的自噬通量。然而，3‐MA不能阻止SGI‐1027的细胞毒性，这排除了自噬作为SGI‐1027的细胞毒性。综上所述，这些发现提示巨泡式死亡与SGI -1027引起的细胞死亡有关。    

SGI‐1027联合依维莫司抑制肾癌细胞增殖

SGI‐1027和依维莫司的联合在肾癌细胞中表现出比单药组更强的细胞毒性。作者进一步构建了ZIP、Bliss和HAS协同评分模型来证实它们的协同作用。结果显示，SGI‐1027和依维莫司之间的相互作用表现出协同效应。随后，深入研究了它们对肾癌细胞增殖的联合细胞毒性。与单独使用依维莫司相比，它们联合使用可导致更大程度的G0/G1期阻滞，这表明SGI‐1027可增强依维莫司诱导肾癌细胞G0/G1期阻滞的功效。    

SGI‐1027和依维莫司协同抑制肾癌细胞集落形成、迁移和侵袭

为了进一步探讨SGI‐1027和依维莫司对肾癌细胞生长的协同作用，作者进行了集落形成实验。伤口愈合试验，结果证实了SGI‐1027与依维莫司联用可以协同抑制肾癌细胞的迁移和侵袭能力。    

SGI‐1027联合依维莫司诱导细胞凋亡和GSDME依赖性焦亡

为了探讨依维莫司与SGI-1027联合使用后细胞死亡的形式，作者在透射电镜下观察了死亡细胞的形态学变化。SGI-1027联合依维莫司治疗24小时后，死细胞表现为细胞肿胀和变圆，质膜产生大泡，染色质凝结，细胞质高空泡。随后，通过流式细胞术分析碘化丙啶（PI）和膜联蛋白V染色证实了细胞死亡的性质。进一步进行乳酸脱氢酶（LDH）释放试验，以探索细胞死亡过程中细胞膜完整性是否丢失。单独使用SGI‐1027或依维莫司并不会增加LDH的释放，但它们的联合使用在9 h后显著增加了LDH的释放，在12 h后达到60%以上，表明细胞膜损伤发生在细胞死亡的早期阶段。鉴于早期质膜完整性丧失是焦亡的一个标志，作者随后研究了SGI‐1027和依维莫司联合使用与焦亡之间的关系。SGI‐1027和依维莫司联合使用可诱导PARP和GSDME的分裂，而不是GSDMD的分裂，这表明它们联合使用可诱导肾癌细胞凋亡和GSDME依赖性焦亡。此外，处理6 h后观察到PARP、GSDME和Caspase 3的裂解，这与LDH释放试验的结果一致。综上所述，这些发现表明SGI‐1027与依维莫司共同诱导肾癌细胞凋亡和焦亡。    

RNA测序分析揭示了协同效应与溶酶体之间的关联    

接下来，进行了RNA测序，以探索SGI‐1027和依维莫司联合诱导焦亡的机制。发现依维莫司组中有429个DEGs上调，104个DEGs下调，SGI - 1027组中有714个DEGs上调，142个DEGs下调，联合用药组中分别有926个DEGs上调，341个DEGs下调。为了准确地研究SGI - 1027和依维莫司的协同作用，使用Venn工具确定了联合组独有的329个上调和212个下调的DEGs。基因富集分析显示，上调的DEGs与多种与焦亡相关的信号通路有关。焦亡和炎症反应相关基因的热图也表明，联合用药组热亡信号被激活。溶酶体相关信号通路在细胞组分（CC）和KEGG富集分析中均排名第一，强调了SGI - 1027和依维莫司与溶酶体和焦亡之间的显著关系。这些发现有力地支持了SGI‐1027诱导细胞分化的能力，并提示溶酶体在SGI‐1027和依维莫司协同作用中的潜在作用。    

SGI‐1027与依维莫司联合诱导肾癌细胞溶酶体膜通透性    

基于RNA测序分析的见解，作者们随后研究了溶酶体在SGI - 1027和依维莫司联合引起的细胞死亡中的作用。首先，利用表达mCherry‐GFP‐LC3B融合蛋白的腺病毒，评估了SGI‐1027与依维莫司联合使用对自溶酶体形成的影响。SGI‐1027诱导肾癌细胞中黄色信号的积累，依维莫司在短时间内放大了这一作用，表明其干扰了自溶酶体的形成。此外，SGI‐1027诱导了LAMP1和LAMP2的降解，但在依维莫司存在的情况下，它相反地引起了LAMP1和LAMP2的积累。这些结果表明，它们的结合破坏了溶酶体的周转，导致溶酶体增大。接下来，通过流式细胞术和Lyso‐Tracker染色检测溶酶体，发现SGI‐1027联合依维莫司在12 h内增强了溶酶体的荧光信号。用吖啶橙（AO）染色进一步阐明了溶酶体的变化。    

靶向LMP和GSDME依赖性焦亡证明了RCC治疗的可行性

作者进一步分析了SGI‐1027和依维莫司联合使用对HK‐2和肾癌细胞的细胞毒性差异。结果表明，4 × 10−6 m SGI‐1027联合10 × 10−6 m依维莫司可导致Caki‐1和ACHN细胞60%以上的细胞死亡，而HK‐2细胞的细胞死亡增加不到20%。此外，作者检测了GSDME在HK‐2细胞和肾癌细胞中的内源性表达。结果表明，786‐O、A‐498、Caki‐1和ACHN细胞表达GSDME的水平显著高于HK‐2细胞（。通过分析150例ccRCC和30例正常肾脏的组织微阵列中GSDME的蛋白表达水平，发现GSDME在ccRCC中的表达显著增加。作者还分析了来自CPTAC数据库的蛋白质组学数据，以探索GSDME在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）组织中的表达。结果表明，与正常肾组织相比，GSDME在ccRCC组织中高表达。此外，GSDME表达与肿瘤分期相关，提示GSDME可能是晚期肾癌的生物标志物。此外，由于肿瘤细胞中溶酶体的数量和活性会影响其对LMP（溶酶体膜通透性）的易感性，作者使用Lyso‐Tracker染色法进一步研究了肾癌细胞和HK‐2细胞之间溶酶体活性的差异。786‐O、A‐498、Caki‐1和ACHN肾癌细胞的溶酶体信号明显高于HK‐2细胞，流式细胞术结果也证实了这一点。因此，研究结果表明，肾癌细胞表现出高水平的GSDME表达和增加的溶酶体活性。基于这些，SGI - 1027联合依维莫司可能是晚期RCC的一种有希望的治疗选择，因为它在诱导LMP和GSDME依赖性焦亡方面具有有益的作用。    

SGI‐1027联合依维莫司在体内发挥协同抗肿瘤作用

最后，作者用a‐498细胞建立了裸鼠异种移植模型，以评估SGI‐1027、依维莫司及其联合用药的体内抗肿瘤活性。最终研究结果表明SGI‐1027可以抑制体内肿瘤生长，并且与依维莫司联合使用可以通过诱导焦亡发挥有效的肿瘤抑制作用，并且具有理想的耐受性。    

文章小结

综上所述，本研究首次发现SGI‐1027在RCC中是一种巨泡式死亡诱导剂，并且SGI‐1027联合依维莫司可通过诱导LMP对RCC细胞产生强大的致死作用，为晚期RCC、依维莫司耐药以及GSDME‐阳性恶性肿瘤的治疗提供了新的解决方案。文章通过发现新的细胞死亡方式、提出新的联合治疗策略、深入研究细胞死亡机制，并在体内外实验中验证了这些发现，思路清晰严谨，对这种新型细胞死亡感兴趣的小伙伴可以直接微信咨询甄博，纯湿实验也好，干湿结合也行，甄博都能帮你一站式搞定！