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昨天分享的科研科研CP“cGAS/STING+线粒体自噬”大家学的怎么样了？思路可一定得理清楚哈~今天咋们继续趁热打铁，再来一篇cGAS-STING信号通路相关文章，这篇文章又有新的发现了，快来做第一个吃螃蟹的人吧。
2023年11月，德国乌尔姆大学医学中心分子病毒学研究所的Konstantin团队在顶刊Nature Communications上发表了题为ARF1 prevents aberrant type I interferon induction by regulating STING activation and recycling的研究论文，该研究揭示了ARF1在cGAS-STING激活和信号终止中的作用。研究利用高通量测序技术、生物信息学工具、免疫共沉淀和质谱分析技术及共聚焦显微镜和超分辨率显微镜技术，进行分析和评估，极大地增加了结果的可靠性。（PS：馆长也可以根据你的研究方向和需求，为你量身定制个性化的课题设计方案，确保你的研究具有创新性和可行性，为你的研究提供坚实的数据支持~有需要速速踢我吧！）
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题目：RF1通过调节STING的激活和循环来阻止I型干扰素的异常诱导
发表时间：2023年11月
研究背景
cGAS-STING信号通路在调控多种细胞功能及人类疾病发生中起着关键作用，尤其是在免疫应答和炎症反应中。ARF1是一种小GTP酶，研究发现其突变（如R99C）与I型干扰素病相关，突变导致ARF1的GTP酶活性降低，从而影响cGAS-STING信号通路的正常功能。
研究主要结果展示
1.ARF1突变定义为I型干扰素病
在一个患有冻疮狼疮皮肤病的患者（AGS460）样本中，发现在ARF1中存在新生c.295C>T/ p.（R99C）替代突变，并通过进一步研究发现ARF1中99号位置精氨酸的突变是一种以前未被识别的人类I型干扰素病的基础。
（a–g）9岁AGS460的手部(a)和面部(b)出现红斑性血管炎冻疮样病变，同一患者18岁时的右手显示明显的组织损失(c)，患者RH2003（d，e）和KW2022（f，g）的手和脚上也观察到类似的病变，年龄分别为18岁和2岁；
（h）ARF1结构域结构示意图。残基R99用红色箭头表示；
（i）多重序列比对显示指定物种中ARF1残基R99的保守性；
（j）患者AGS3133的ISG概况（红色）与27名健康捐赠者的平均ISG概况（蓝色）。
2.ARF1 R99C诱导STING依赖性I型IFN激活
在稳定表达STING（293-23-R232）的HEK293细胞中发现，ARF1 R99C的瞬时表达足以诱导剂量依赖的I型IFN信号传导，且99位点的任何替代都会导致慢性I型IFN释放，ARF1 R99C诱导I型IFN信号通路需要STING，内源性cGAS-STING蛋白足以诱导信号传导。
与ARF1 R99C共转染后进一步研究发现，内源性STING蛋白数量的减少与STING激活导致的降解相一致，患者样品的研究结果再次验证了这一点。
（a）瞬时表达FLAG标记的ARF1 WT、R99C、Q71L或T31N的293-Dual-hSTING-R232细胞中SEAP报告基因的ISRE启动子活性（转染后32小时并标准化为细胞活力），下图：用抗FLAG染色的全细胞裂解物(WCL)的相应免疫印迹；
（b）(a)中数据的曲线下面积分析；
（c）在瞬时表达STING(+STING)或空载体(-STING)以及FLAG标记的ARF1 WT和R99C的HEK293T细胞中，通过Firefly荧光素酶(Fluc)定量测定ISRE启动子活性（转染后32小时，并标准化为GAPDH-海肾荧光素酶）。下图：抗FLAG染色的WCL的相应免疫印迹；
（d-e）用ARF1 WT和R99C转导的A549 Dual细胞中的ISRE (d)或NF-κB (e)启动子活性，下图：用抗FLAG、抗STING和抗GAPDH染色的WCL的相应免疫印迹；
（f）瞬时表达指定ARF1构建体、cGAS和STING的HEK293T WCL的示例性免疫印迹，印迹用抗pTBK1、抗TBK1、抗IRF3、抗FLAG和抗GAPDH染色；
（g）（f）中pTBK1带强度的量化，标准化为TBK1；
（h）转导后72小时转导表达ARF1 WT和R99C的原代正常人肺成纤维细胞中OAS1 mRNA的qPCR，下图：用抗FLAG、抗STING和抗GAPDH染色的WCL的相应免疫印迹；
（i）将来自健康供体(n1、f1)或患者(AGS460)的原代成纤维细胞的上清液(SN)转移至293-Dual-hSTING-R232细胞，转移后48小时SEAP (ISRE)活性并标准化为细胞活力。
3.ARF1 R99C破坏线粒体，将mtDNA释放到细胞质中
在WT和cGAS-KO的THP-1单核细胞中通过慢病毒转导表达ARF1 WT和R99C，发现IFN信号仅在cGAS存在的情况下被诱导，表明cGAS促进了ARF1 R99C诱导的I型IFN信号转导。电镜显示ARF1 R99C存在时线粒体被破坏，R99c表达细胞的线粒体中可见小的电子致密颗粒，提示线粒体损伤。在mtDNA缺失后，ARF1 R99C表达诱导的IFNB1、Mx1和RSAD2的表达也降低了。这些数据表明ARF1 R99C的表达促进线粒体结构异常和mtDNA的释放以及cGAS的激活，最终诱导ISG的异常激活。
进一步电镜分析发现，在ARF1 R99C的存在下，线粒体分支长度增加，线粒体融合标记物MFN1在ARF1 R99C存在时显著积累，而在ARF1 WT中没有积累。在酵母中，进一步表明ARF1 R99C通过MFN1的积累促进线粒体的超灌注，导致mtDNA渗漏到细胞质中。
（a）ISRE启动子活性通过转导表达ARF1 WT或R99C的THP-1-Dual WT（灰色）或cGAS KO（粉色）中的Lucia荧光素酶(LLuc)进行定量，下图：抗FLAG、抗STING、抗cGAS和抗GAPDH染色的WCL的相应免疫印迹；
（b）瞬时表达ARF1 WT或R99C的HEK293T细胞的示例性电子显微镜分析；
（c）示例性免疫印迹显示瞬时表达ARF1 WT、R99C、Q71L或载体的HEK293T细胞的分级；
（d）(c)胞质部分中mtDNA (MT-D-Loop)的qPCR；
（e）健康供体(n2、f1、I7)或患者(AGS460)的原代成纤维细胞胞质部分中mtDNA (MT-D-Loop)相对于总标准化细胞mtDNA（mtDNA/核 DNA）的qPCR；
（f）对稳定表达STING并通过ddC或未经处理(NT)耗尽mtDNA的U2OS细胞中的OAS1 mRNA进行qPCR；
（g）瞬时表达TagRFP标记的ARF1 WT、R99C或载体对照（红色）的HeLa细胞的示例性活细胞共焦激光扫描显微镜图像；
（h）分析图像的周长、圆度、分支长度（每个细胞）和分支（每个细胞）；
（i）瞬时表达ARF1 WT、R99C或载体的HEK293T细胞的WCL免疫印迹示例，印迹用抗MFN1、抗RHOT1、抗FLAG和抗GAPDH染色；
（j）对瞬时表达ARF1 WT、R99C或载体对照的HEK293T细胞胞浆部分中的mtDNA (MT-D-Loop) 进行qPCR，以及标准化为细胞mtDNA（mtDNA/核 DNA）的VCP。
4.R99突变会损害ARF1 GTP酶活性以及与COPI复合物的关联
结构分析显示，R99残基并不直接参与与GTP或其他ARF1相互作用伙伴的结合；亲和蛋白分析显示，R99C突变显著降低了与COPI通路蛋白的相互作用。
上述结果表明，R99C降低了构象稳定性、GTPase活性以及ARF1与COPI复合物组分的关联性。
（a）ARF1 (PDB: 2J59) ATP结合模型（橙色/黄色），R99和D26突出显示；
（b-c）ARF1 WT (b)或R99C (c)与GTP的相互作用以及通过荧光热位移测定分析的蛋白质稳定性；
（d）从表达FLAG-ARF1的HEK293T细胞中纯化得到的所示ARF1突变体的GTP酶活性，下图：用抗FLAG染色的相应免疫印迹；
（e）通过瞬时表达ARF1 WT或R99C的SEAP定量293-Dual-hSTING-R232细胞中的ISRE启动子活性，并指示GEF或GAP标准化为细胞活力。用抗HA、抗-turboGFP (tGFP)、抗-FLAG、抗-STING和抗-GAPDH染色的WCL的相应免疫印迹；
（f）通过SILAC质谱法评估ARF1 WT与HEK293T细胞中R99C大规模纯化的蛋白质丰度；
（g）(f)中与ARF1 R99C相关性较低的前30个蛋白质的GO分析(PantherDB)；
（h）使用来自瞬时表达FLAG-ARF1 WT、R99C或载体的HEK293T细胞WCL的抗FLAG珠进行免疫共沉淀，免疫印迹用抗COPB、抗ARF1和抗GAPDH染色。
文章小结
该研究揭示了ARF1在确保线粒体完整性和高尔基-内质网STING逆转运防止cGAS-STING通路异常激活的关键作用，对ARF1依赖性I型干扰素病的靶向治疗方法提供了研究支持。研究中使用了健康个体和ARF1突变患者的原代人成纤维细胞进行实验，增加了研究结果的生理相关性和临床适用性，临床意义也直接拉满！“临床问题”与“科研热点”的丝滑结合，对咋临床医生来说已经是大势所趋了，看大家能否理解其中的思路，并拿来一部分借鉴到自己的课题中去~Ps：想申请基金项目，又想丝滑的结合热点，但是思路上欠缺一些想法和设计，来找馆长帮你吧，省时省力一步到位全搞定！
馆长有话说
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