近年来，细胞衰老的相关研究越来越多，尤其在肿瘤领域。在国自然申请项目中，“细胞衰老”的中标量日益增长。《Hallmarks of Cancer》第三版中，衰老细胞被列为新增的重要特征之一，表明了“细胞衰老”在未来科研中的巨大潜力。
今天馆长带来的这篇文章《CDK4/6 inhibitor PD-0332991 suppresses hepatocarcinogenesis by inducing senescence of hepatic tumor-initiating cells》来自同济大学何志颖教授团队，该研究探讨了CDK4/6抑制剂PD-0332991在肝细胞癌（HCC）发生前的阶段抑制肝癌发生的效果，及其作用机制，以及如何通过影响该通路来诱导细胞衰老，为肝癌的治疗提供了一种新的干预策略。文章设计思路上也是添加了生信相关分析，干湿结合，逻辑链条完整，是一篇非常值得学习的文章！好思路不等人，想做方案设计和数据分析的朋友直接滴滴馆长就可以了，如果有方案未敲定我们也可提供评估服务哦~
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题目：CDK4/6抑制剂PD-0332991通过诱导肝肿瘤起始细胞衰老抑制肝癌发生
杂志：Journal of Advanced Research
影响因子：11.4
发表时间：2024.8
研究背景
由于肝细胞癌(HCC)的治疗选择有限，针对HCC前阶段的干预措施引起了越来越多的关注。在HCC前阶段，肝肿瘤起始细胞(hTICs)异常增殖并促进肝癌的发生。许多研究已经对靶向衰老诱导作为HCC干预进行了研究。然而，hTICs诱导衰老是否可以作为HCC前的干预措施仍有待明确。
研究思路
研究结果
PD-0332991有效抑制CLI（慢性肝损伤）小鼠模型的肝癌发生
为了研究CDK4/6抑制剂PD-0332991对CLI诱导的肝癌发生的影响，将PD-0332991给予8周CLI的Fah-/-小鼠。与对照组相比，HCC的发病率从100%下降到29.15%。肿瘤的大小和数量均明显减少。HCC的发展明显延迟。
为了验证在CLI-HCC Fah-/-小鼠模型中获得的结果，作者使用了另一种典型的CLI-HCC小鼠模型（N-Ras + AKT小鼠）。结果也显示PD-0332991治疗组肿瘤数量、肿瘤直径、最大肿瘤直径、肝重比(肝重:体重)均明显降低，肿瘤结节数量也明显减少。综上所述，这些结果表明细胞周期抑制剂PD-0332991有效地阻止了CLI的肝癌发生。
PD-0332991诱导CLI小鼠肝细胞衰老，但不诱导凋亡
为了探讨两种CLI小鼠模型中HCC发生率降低的原因，作者首先通过检测细胞衰老标志物SA-β-Gal、P21以及SASP因子的表达变化，研究了PD-0332991是否影响HCC前期的细胞衰老。结果发现PD-0332991处理的Fah-/-小鼠肝脏组织中SA-β-Gal阳性细胞比CLI处理的Fah-/-小鼠多。N-Ras + AKT + PD组肝脏中SA-β-Gal+和P21+细胞的比例明显高于未治疗组。
然后，分析了Fah-/-小鼠肝脏样品中SASP因子的表达变化。定量分析显示，PD-0332991处理Fah-/-小鼠肝脏样品中关键炎症因子(CCL2、CCL4、CCL20和CXCL10)的表达水平升高。此外，核中间丝蛋白和衰老细胞标志物Lamin B1的表达下降，进一步表明，PD-0332991在Fah-/-小鼠的一些肝细胞中诱导了细胞衰老。
PD-0332991诱导CLI小鼠肝脏TICs衰老
由于肝细胞在CLI下失去了增殖和更新的能力，作者推测PD-0332991主要针对增殖的肝细胞和部分或全部发生恶性转化的细胞，并诱导这些细胞衰老。MCM2是DNA复制起始复合物的一个组成部分，仅在增殖细胞的细胞核中组装，并在整个细胞周期中稳定存在，包括G1、S、G2和M期。因此，选择MCM2来鉴定增殖和静止(G0期)肝细胞。
免疫荧光共染色显示，与对照组相比，PD-0332991处理小鼠的MCM2+细胞比例显著降低。同时表达MCM2的主要细胞亚群显示P21免疫染色阳性。结果表明，PD-0332991可选择性诱导肝脏中增殖（非G0期）肝细胞衰老，而对静止状态（G0期）肝细胞无诱导作用。
在晚期CLI中，hTICs是一种表现出异常增殖的肝细胞亚群。进一步利用一系列hTIC相关的干细胞标记，确定了诱导的衰老细胞是否主要来源于癌前阶段这些恶性转化的肝细胞，并发现hTIC出现在Fah-/-和N-Ras + AKT小鼠的肝脏中。然而，PD-0332991减少了肝脏中hTIC的数量，这与HCC发病率的下降呈正相关。通过P21和GSTp的免疫荧光共染色，发现在PD-0332991处理的小鼠肝脏切片中，衰老细胞与hTICs共定位，表明给药PD-0332991后，CLI小鼠肝脏诱导衰老。
PD-0332991体外诱导慢性损伤肝脏hTIC细胞衰老
为了进一步阐明PD-0332991靶向hTICs诱导细胞衰老的作用，作者从Fah-/-小鼠肝脏中分离hTICs，通过小鼠hTIC的体外分选和表征，作者验证了分离的hTIC的侵袭性。将hTICs原位移植到Fah-/-小鼠的肝脏中，并给予4周的CLI。正如预期，hTICs移植组的继发性HCC节点数量高于对照组(非TICs移植的Fah-/-小鼠)。
为了验证PD-0332991的敏感性，作者体外培养两种CLI小鼠模型的聚集性hTICs和非TICs，并对其进行PD-0332991处理。PD-0332991处理后，hTICs的增殖能力下降比未干预的更严重。此外，PD-0332991处理后，SA-β-Gal+ hTICs的比例增加，进一步表明PD-0332991可以特异性诱导hTICs衰老。
为了进一步分析PD-0332991诱导体外hTICs细胞衰老的潜在机制，作者分析了相关信号通路的蛋白表达。PD-0332991处理48小时后，hTICs中磷酸化Rb （pRb）和Cyclin D1水平显著降低，而P21水平升高。上述结果表明，PD-0332991通过有效抑制Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb通路的激活，抑制Rb蛋白的磷酸化，进而抑制hTICs的G1/S转变，最终导致hTICs衰老，从而抑制HCC的发生。
PD-0332991抑制细胞周期蛋白D-CDK4/6-INK4-Rb途径在CLI到HCC发展过程中的激活
为了探索癌前病变向HCC转变过程中的途径变化，作者从GEO数据库中获得了RNA-seq数据。在数据集中，根据分化程度将DN（发育异常的结节）进一步分为低级DN（DL）和高级DN (DH)。HCC样本的组织病理学分级分为TG1、TG2和TG3期。对所有样本中的上调基因进行GO富集分析。DL、DH和TG1样品中富集了一系列细胞周期相关通路，表明癌前病变中细胞周期已经被激活。
接下来，使用ssGSEA评估了这些数据集中Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb通路的激活评分，发现该通路激活评分在癌前病变中突出，在DL样本中达到最高水平。
为了验证PD-0332991治疗前后对肝细胞和hTICs是否也有类似的趋势，作者对CLI治疗的Fah-/-小鼠和PD-0332991治疗的Fah-/-小鼠的肝组织进行了转录组测序分析。病进行基因聚类，筛选出测序数据中具有相同连续趋势的基因簇。结果表明cluster 4中的基因主要富集在细胞周期、RNA剪接等方面。第6簇基因主要富集于脂肪酸、脂质代谢等方面，说明细胞周期相关通路逐渐被激活，而代谢相关通路在CLI的发展过程中逐渐被抑制，说明PD-0332991处理抑制了细胞周期相关通路，激活了代谢相关通路。
作者验证了这些趋势是否也存在于蛋白质水平的变化中。从不同程度CLI的Fah-/-小鼠肝脏样品中提取蛋白质，检测Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb通路相关蛋白的表达水平。Cyclin D1、CDK4、CDK6、pRb等关键蛋白的表达水平随着CLI的进展而升高。RNA-seq分析显示，PD-0332991处理后，Fah-/-小鼠细胞周期相关基因显著下调，尤其是Cyclin D1。pRb和Cyclin D1水平明显下降，表明PD-0332991通过靶向Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb途径抑制细胞增殖。
hTICs的衰老监测抑制肝癌的发生
PCR和免疫印迹验证证实关键SASP因子的表达增加。分析和验证显示，PD-0332991处理的CLI小鼠的肝脏以及体外衰老hTICs中，两种SASP因子CCL2和CXCL10的表达升高。定量PCR进一步检测到PD-0332991处理后CLI小鼠肝脏中F4/80和CD86表达增强，表明M1巨噬细胞向CLI小鼠肝组织浸润增加。在PD-0332991处理的CLI小鼠中，观察到CCR2和CXCR3的表达明显上调。组织化学分析显示，PD-0332991处理小鼠肝脏中衰老hTIC周围巨噬细胞募集显著增加。
为了阐明衰老TIC对免疫系统的激活作用，采用基于流式细胞术的多色分析来鉴定Fah-/-小鼠肝脏内免疫细胞群比例的差异。分析显示，与对照组相比，PD-0332991处理的CLI小鼠邻近非肿瘤组织中巨噬细胞的比例显著增加。巨噬细胞激活后分泌的肿瘤坏死因子α (TNF-α)的表达也显著升高。
综上所述，这些实验结果表明，CDK4/6抑制剂可有效诱导hTIC衰老，导致SASP因子CCL2和CXCL10的高表达，进而激活和招募巨噬细胞，促进抗肿瘤免疫，减缓肝癌的发生。
文章小结
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