哦哈哟！馆长又来啦！开门见山，馆长直接透题！今天馆长要给友友们好好说道说道——网药分析！考考你们，一般网药分析的流程是什么呀？首先，我们会筛选药物活性成分，并进行靶点预测；接着，通过数据库检索与疾病相关的靶点，构建成分-靶点-疾病的相互作用网络，分析关键节点，最后通过功能富集分析，揭示药物作用的途径和机制。复习完毕！那今天馆长要带来的是一篇非常新颖的网药分析——《Integrated network pharmacology and transcriptomic approach reveal the role of equol in reducing colorectal cancer via regulating multiple cell cycle genes in HCT116 cells》，这篇研究根据转录组学数据直接识别了差异表达基因，还通过细胞实验和分子实验验证关键靶点和通路的作用，转录组+网药分析+分子对接+实验验证！这套组合一上桌，其它网药分析可以稍微靠边啦！网药分析发了这么多文章，但这个组合直接拿下7.7分，三个月就接收！套路常学常新呀～感兴趣的同学，不要放过这次机会，快跟馆长一起学习这个套路吧！
1本研究通过网络药理学和转录组学分析发现，Equol通过多途径抑制结直肠癌，显示出其作为结直肠癌辅助治疗关键成分的潜力。
2本研究通过分子对接预测了Equol与细胞周期相关蛋白的相互作用，结果显示Equol可以通过形成氢键与多个靶标结合，提示了Equol作为多靶点抗癌化合物的潜力
3本研究通过对关键靶基因（如CDK1、CCNA2、E2F1）的蛋白表达水平进行Western Blot分析，以验证网络分析结果，增加了结果的可靠性
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题目：整合网络药理学和转录组学的方法揭示了Equol在通过调控HCT116细胞中多个细胞周期基因来抑制结直肠癌的作用
杂志：Int J Biol Macromol
影响因子：IF=7.7
发表时间：2024年11月
后台回复“666”获取原文献，编号241124
研究背景
结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，也是第二大癌症死亡原因。寻找具有低毒性的替代性、有效抗结直肠癌药物迫在眉睫。Equol作为大豆异黄酮代谢产物，具有类雌激素的生物活性及抗炎潜力，已在多种癌症模型中显示出较强的抑制活性。研究表明Equol可剂量依赖性地抑制结肠癌细胞增殖，但其分子机制仍不清楚。网络药理学为多层次解析药物作用机制提供了新方法。本研究整合网络药理学与转录组学方法，深入探讨Equol抗结直肠癌的分子机制，以期揭示其作为抗癌剂或辅助治疗成分的应用潜力。
研究思路
首先通过CCK-8、划痕愈合和集落形成实验，分析Equol对癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。然后，利用RNA测序分析探究Equol抑制癌细胞增殖和诱导细胞周期停滞的机制，并进行了GO功能和KEGG富集分析解差异表达基因（DEGs）相关的功能和通路。接着，利用STRING数据库筛选出核心基因并构建蛋白质相互作用网络，并通过iRegulon工具预测调控这些基因的关键转录因子。随后，采用Western blot方法检测关键蛋白的表达，进一步确认Equol的抑制效果。最后，通过CDOCKER进行分子对接分析并结合PyMOL进行可视化，从分子水平揭示Equol与靶蛋白的相互作用。
研究结果
1、Equol抑制细胞增殖、迁移和集落形成
为分析Equol对癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，进行了CCK8实验、集落形成实验和伤口愈合实验。结果表明，Equol在剂量和时间依赖性下抑制了四种人结直肠癌细胞系（HCT116、HT29、SW480和Caco2细胞）的增殖（图1a）。此外，经过24小时处理后，HCT116、HT29、SW480和Caco2的IC50值分别为79.0μg/mL、57.6μg/mL、94.5μg/mL和147.0μg/mL。此外，选择了具有较低IC50值的HCT116和HT29结直肠癌细胞系进行伤口愈合实验和集落形成实验，以测试Equol对肿瘤形成和癌细胞迁移的影响。经过24小时孵育，Equol浓度达到≥40μg/mL和80μg/mL时，分别抑制了HCT116和HT29细胞的迁移（图1b）。集落形成实验显示，与对照组相比，Equol以20μg/mL浓度显著抑制了HCT116和HT29细胞的集落形成能力，而当使用40μg/mL的Equol时，几乎未观察到集落形成（图1c）。这些结果表明，Equol能够抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和集落形成，并选择对Equol敏感性较高的HCT116细胞进行进一步实验。
图1.Equol对细胞增殖、迁移及集落形成的影响
2、Equol诱导细胞周期停滞并促进细胞凋亡
使用流式细胞术评估Equol是否可以诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。图2a显示了HCT116细胞群的不同周期阶段：G0/G1、S和G2/M。Equol诱导了G0/G1期停滞，不同剂量的Equol引起了不同水平的G0/G1期细胞积累。此外，Equol处理后G2/M期细胞的比例有所增加，但并不显著。细胞凋亡的流式细胞术结果见图2b，凋亡率与Equol的剂量呈正相关。这些结果表明，Equol能够以剂量依赖性方式诱导细胞周期停滞并促进细胞凋亡。
图2.HCT116细胞周期及凋亡变化的流式细胞术分析
3、Equol在HCT116细胞中诱导了独特的基因表达模式
为了探究Equol抑制癌细胞增殖和诱导细胞周期停滞的机制，利用RNA测序进行了转录组分析。对照组（CK）和Equol处理组（EQ）的基因在韦恩图中展示（图3a），在CK和EQ组中分别检测到14,910和14,812个基因。其中14,070个基因在CK和EQ组中均有表达，而分别有840和742个基因仅与CK组和EQ组相关。基于差异表达的筛选标准，在EQ和CK组间鉴定出1685个差异表达基因（DEGs），其中739个基因在EQ组中上调，946个基因下调（图3b）。PCA分析用于将具有差异基因表达的样本分为不同的簇。从PCA得分图（图3c）中可以看出，样本沿第一主成分（PC1）清晰地分为两个簇，占方差的84.87%。因此，显然Equol处理的癌细胞（HCT116细胞）基因表达发生了变化。差异基因的层次聚类和热图分析如图3d所示。热图中明显的模式表明Equol处理在HCT116细胞的转录组中引起了显著的变化。这一观察结果有力支持了研究团队的假设，即Equol对结直肠癌细胞的基因表达模式具有显著影响。
图3.基因表达分析
4、GeneCards数据库中生物过程靶标的筛选
为了探讨Equol抑制癌细胞增殖、集落形成和迁移并诱导细胞周期停滞及细胞凋亡的机制，使用生物过程-靶标网络揭示生物过程与靶标之间的关系。从GeneCards数据库中共获得了与细胞增殖、细胞周期、细胞迁移、集落形成和细胞凋亡相关的1569个基因。通过对1569个生物过程靶标和转录组学的1685个DEGs取交集，筛选出168个共享基因（图4a）。
图4.核心生物过程靶标的筛选及其通过Western blot分析的验证
5、生物过程-靶标网络构建及核心基因筛选
为识别168个共享基因的潜在相互作用，利用STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）。去除游离基因后，网络中包含了168个候选基因中的112个基因，共有112个节点和310条边（图4b）。节点的度值越高，节点越大，颜色越深。节点的高度值表明其在网络中的重要性，因为其高相互作用数可能与观察到的效果相关。使用Cytoscape插件MCODE识别具有相似生物功能的基因簇。如图4c所示，识别出四个显著模块，MCODE得分均>4。模块1包含13个节点和76条边；模块2、3和4各包含4个节点和6条边。CytoHubba插件用于探究网络中的关键节点和子网络，共选出17个最大团中心性（MCC）>5000的候选基因，见图4d。这些基因属于模块1和模块2。MCODE和CytoHubba分析结果表明，这17个基因是Equol在结直肠癌治疗中的关键靶标。图4e展示了17个核心基因之间的相互作用。
图4f显示了17个核心基因的基因表达分析结果。在这些核心基因中，EQ组中与细胞凋亡相关的基因表达减少。与细胞周期相关的基因在EQ组中表达降低。与集落形成相关的基因在EQ组中表达减少。与细胞迁移相关的基因）在EQ组中也显示出表达减少。此外，促进细胞增殖的基因在EQ组中呈现低表达。
6、核心基因集合的预测转录因子
使用iRegulon插件识别核心基因的转录因子（TF）。图4g显示了TF-基因靶标调控网络，其中17个核心基因中的13个被核转录因子Y亚单位α（NFYA）调控。TFE2F1被发现调控6个核心基因。TFNFYA和E2F1的原始基因表达值见图4h。在Equol处理癌细胞后，这两个TF下调。
7、核心基因的蛋白表达的Western blot分析
为进一步揭示Equol的抗结直肠癌机制，使用Western blot分析了细胞周期初始因子蛋白CCND1和几个核心蛋白CDK1、CCNA2和CCNB1的表达。此外，还通过Westernblot检测了两个TFNFYA和E2F1的表达。如图4i所示，将癌细胞暴露于80μg/mL的Equol后，CDK1、CCNA2、CCND1、E2F1和NFYA的表达下降，而将细胞暴露于40μg/mL的Equol后CCNB1的表达下降。
8、目标蛋白与Equol的分子对接分析
应用分子对接预测Equol与17个核心候选蛋白靶标之间的潜在相互作用。发现Equol与CDK1、CCNA2、BUB1B、ASPM、FOXM1和CCND1的周围氨基酸残基形成多个氢键。靶蛋白与Equol之间氢键的数量表明分子间具有较强的结合力。
文章小结
本篇研究不基于数据库去预测药物成分的潜在靶点，把重点放在基因表达层面，通过识别作用机制中起重要作用的核心模块和中心基因，去揭示该成分的多途径作用机制，并进一步探讨了在细胞周期调控中的具体作用机制，秒！实在是秒！馆长认为，本文关键在于研究团队巧妙的结合了多组学和网药分析，所以有一个好ideal真的很重要！别人需要看大量文献才能抓住ideal，而你，只需要拥有馆长即可！快来找馆长领取你的ideal吧～
馆长有话说
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