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1.研究思路清晰合理：通过单细胞测序（scRNA-seq）技术对肝内胆管癌（ICC）患者的肿瘤、正常和淋巴结组织进行了深入分析，揭示了肿瘤相关内皮细胞（TECs）在肿瘤血管生成中的作用及其显著的异质性。
2.多组学整合分析更具说服力：单细胞测序整合多组学分析方法为ICC的预后评估和治疗提供了全面的视角。
3.具有实际研究意义：通过研究分析提出的增强CXCL12/CXCR4信号通路的调节可能对ICC有促进作用，为ICC治疗提供了新策略。（PS：科研上分之路遇到困扰了吗？还在担心实验如何搞定吗？来联系馆长呀~馆长不仅可以帮你搞定生信分析思路，还有高性能服务器解决你的数据分析需求！一条龙服务快来找我吧！）
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题目：综合多组学分析揭示了肿瘤相关内皮细胞在肝内胆管癌预后中的作用及其特征
杂志：Journal of Translational Medicine
影响因子：IF=6.1
发表时间：2024年10月
后台回复“666”获取原文献，编号241119
Ps：馆长已经把原文信息放在末尾啦~~~小伙伴们自己去拿哦
研究背景
肝内胆管癌（ICC）是仅次于肝细胞癌（HCC）的第二常见的肝脏恶性肿瘤。目前治性手术切除仍然是ICC唯一可能治愈的治疗方法。肿瘤微环境（TME）在肿瘤血管生成、免疫逃避和转移中扮演着关键角色，但其在ICC中的具体作用和临床意义尚不完全清楚。深入了解ICC免疫微环境中的相互作用和确定潜在的治疗靶点对于预测免疫治疗反应、评估疗效、发现预后标志物和指导个体化治疗策略至关重要。
研究思路
本研究对肝内胆管癌（ICC）患者的肿瘤组织、正常组织和淋巴结组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以揭示tec在肿瘤血管生成中的作用及其显著的异质性。同时鉴定TEC中高表达的基因，并构建了TEC特征（TEC.sig）。随后基于TEC.sig计算样本的TEC分数。通过空间转录组学分析和组织学实验进一步证实，TECs通过CXCL12/CXCR4轴与多种肿瘤杀伤免疫细胞相互作用。
研究结果
1.ICC的TME景观
本研究获得肿瘤和病人腹部淋巴结样本进行scRNA测序。将数据与先前发表的ICC scRNA-seq数据集相结合，无监督聚类识别了多个细胞簇（图1A），在样本之间没有显著的批效应（图1B）。基于典型标记基因表达将其分为T细胞、NK细胞、上皮细胞、骨髓细胞、B细胞、成纤维细胞、循环细胞和内皮细胞（图1C）。8种细胞类型在不同样本中的分布差异很大：NK细胞和上皮细胞主要存在于肿瘤组织中，而B细胞和浆细胞主要存在于淋巴结中（图1D-F）。
图1 ICC TME内的免疫浸润景观
2.ICC TME中TECs的异质性
研究共鉴定出1643个具有显著异质性的TECs。通过聚类分析，将所有TECs分为五个不同的细胞簇：MGP+Endo、NPIPB4+Endo、FCGR2B+Endo、IGLC3+Endo和PDPN+Endo（图2A）。内皮细胞亚群的分布在不同组织中表现出显著差异（图2B），MGP+Endo和FCGR2B+Endo主要富集于正常组织，NPIPB4+Endo和IGLC3+Endo主要富集于淋巴组织。PDPN+Endo和NPIPB4+Endo亚群主要存在于肿瘤组织中。富集分析显示，细胞中过度表达的基因主要与血管生成和细胞外基质重塑相关（图2C）。每个内皮细胞簇都表现出不同的基因表达模式（图2D-E）。
图2 内皮细胞群的特征和功能分析
3.基于TEC标记基因的三基因预后标记的建立和验证
研究通过cv.glmnet函数进行十倍交叉验证降低模型过拟合的风险。选择了19个具有非零系数的变量（图2F-G），并通过Cox多元回归分析，确定了3个基因作为ICC患者的独立预后因素（图2H）。此外研究发现ICC患者的预后随着TEC评分的增加而恶化（图2I），随机森林生存分析结果也表明CLIC4表达水平是对TEC评分影响最显着（图2J）。将244名ICC患者分为高TEC评分组和低TEC评分组，并通过Kaplan-Meier曲线进行分析，发现与低TEC评分组相比，高TEC评分组的预后较差（图2K）。
4.TEC评分和肝内转移被认为是预测ICC患者预后的可靠因素
为了进一步检查TEC评分与ICC患者临床特征之间的关联，进行全面的相关性分析。结果表明，TEC评分与患者年龄、性别、肿瘤直径、胆结石病史或乙型肝炎表面抗原状态无关（图3A），但与血管侵袭、神经周围侵袭、远处转移、肝内转移和TNM分期有明显相关性（图3B）。通过单因素Cox回归分析表明，包括肝内转移、肿瘤大小、微血管浸润在内的多个因素会显著影响ICC患者预后（图3C），而Cox多因素回归分析进一步证实肝内转移、区域淋巴结转移、ALT水平、TEC评分是影响ICC患者预后的独立危险因素（图3D）。值得注意的是，研究发现TEC评分与肝内转移的发生可能存在相关性（图3E），通过生存分析显示ICC合并肝内转移的患者预后较差（图3F）。根据肝内转移、区域淋巴结转移、ALT水平和TEC评分构建了预测ICC患者预后的诺模图（图3G），并通过ROC曲线和校准曲线证实了ICC患者1年和3年生存率较高（图3H-I）。
图3 TEC评分、临床特征与预后的关系分析
5.TEC评分反映TME中免疫抑制细胞的浸润程度
研究对TEC评分与免疫细胞浸润的关系进行了探讨,发现高和低TEC评分组之间免疫细胞浸润存在显著差异（图4A）。结果表明高TEC评分组S100A家族成员的mRNA和蛋白水平显著升高（图4B）。此外在高TEC评分组的TME中，免疫抑制性中性粒细胞和iDC的数量显著增加（图4A），而低TEC评分组CD8A、GZMA和PRF1mRNA水平升高，进一步证实了抗肿瘤免疫反应的升高（图4C）。Kaplan-Meier曲线结果显示，中性粒细胞、Th2细胞和iDCs高浸润的ICC患者预后较差，而CD8+Tem高浸润的ICC患者预后则相反（图4D），进一步证明高TEC评分组ICC患者可能表现出以炎症为主的免疫抑制表型（图4E）。免疫浸润分析显示，HBV阳性ICC患者TME中对免疫细胞适应性显著增加，而免疫抑制性骨髓细胞无显著差异（图4F）。
图4 TEC评分与TME免疫细胞浸润的关系分析
6.CXCL12和KRAS突变的过表达影响TME中性粒细胞和iDC浸润
研究对趋化因子CXCL12通过与受体CXCR4或CXCR7的相互作用是否调节白细胞定向迁移进行了分析，结果发现低TEC评分组的CXCL12表达水平显著升高（图5A），CXCL12mRNA水平较高的患者预后更好（图5B），CXCL12mRNA水平与致癌因子、中性粒细胞和iDC的浸润呈负相关，与抑癌因子、NK、CD4+T和CD8+Tem细胞的浸润呈正相关（图5C-D）。此外，研究发现与高TEC评分相比，低TEC评分组的TIDE和功能障碍评分最低（图5E）。进一步对与免疫学特征相关的基因组改变进行了分析，分析结果发现低TEC评分组主要突变基因为BAP1、TTN和ARID1A，总体突变频率为69.75%（图5F），高TEC评分组的主要突变基因为KRAS、TP53和TTN，总体突变频率为84.87%（图5G）。通过Kaplan-Meier曲线分析发现携带KRAS突变的患者预后较差（图5H），同时免疫细胞浸润分析发现KRAS突变患者的NK、B、CD4+T和CD8+Tem细胞显着减少，中性粒细胞和iDC浸润显着增加，TEC评分较高但预后较差（图5I-J）。
图5 CXCL12表达水平、KRAS突变与TME免疫细胞浸润的关系分析
7.TECs通过CXCL12/CXCR4轴与各种免疫细胞相互作用
通过对细胞间通信网络的分析检查发现TEC与TME中的各种免疫细胞之间存在显着的相互作用（图6A）。对涉及TEC和其他细胞类型之间相互作用的受体-配体对的进一步分析表明，CXCL12/CXCR4是TEC相互作用的主要信号轴（图6B）。空间转录组反卷积分析进一步证实了TEC与T细胞和B细胞的空间共定位（图6C-E），而多重免疫荧光染色实验也进一步证实了CXCL12高表达水平的TEC对T细胞和B细胞有趋化作用（图6F），而低表达的TEC则没有表现出这种趋势（图6G）。
图6 TECs与T细胞和B细胞相互作用
8.预测模型的性能评价
研究基于GEO数据库对TEC.Sig与免疫治疗应答之间的关系进行确认。结果表明，TEC.Sig可以显着预测HCC患者的免疫治疗结果（图7A）。TEC.Sig在MGSP和IMvigor210数据集中也显示出较高的预测价值，AUC值分别为0.78和0.73（图7B–C）。与先前研究相比，TEC.Sig表现出更高的AUC值（图7D-F）。所有结果表明TEC.Sig在预测免疫治疗反应方面表现出可靠的准确性。
图7 TECs与T细胞和B细胞相互作用
文章小结
本研究揭示了TEC在ICC TME中的复杂作用，并为ICC治疗提供了新的生物标志物和潜在靶点。未来的研究可以探索TEC与免疫细胞之间的相互作用，并评估tec作为ICC治疗的生物标志物和靶点的使用。（PS：通过单细胞与多组学数据集分析拿下6分+轻松复现，还不快跟上单细胞的快车？换个疾病思路你也行！有问题快来找馆长，帮你私人定制一切！有问题统统拿下！）
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https://doi. org/10.1186/s12967-024-05750-2.
