江南大学翟齐啸教授:短双歧杆菌调节乳酸以抑制大肠杆菌的扩增并缓解炎症性肠病

学术   2024-10-22 07:38   湖北  
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Abstract
抑制大肠杆菌的异常增殖对于缓解炎症性肠病至关重要。由于肠道微生物群的复杂性,专门靶向和抑制特定微生物是一项具有挑战性的任务。一种方法涉及筛选拮抗大肠杆菌的益生菌;然而,这个过程通常需要使用大量的益生菌进行广泛的体外实验。在这项研究中,采用基因组规模的代谢预测模型来预测803株微生物与大肠杆菌之间的相互作用。结果表明,短双歧杆菌和动物双歧杆菌表现出最有效的抑制作用。体外抗菌试验和小鼠实验验证了短双歧杆菌CCFM1369的抑制效果。此外,短双歧杆菌CCFM1369显示出抑制关键基因LdhaHIF-2α并降低管腔乳酸浓度的能力,从而降低大肠杆菌的定植能力。这些发现支持短双歧杆菌在缓解结肠炎方面的潜在应用。





Introduction
炎症性肠病(IBD)对生活质量和胃肠道健康构成严重威胁,导致结肠炎症的易感性升高。而IBD常常与肠道微生物群有所联系。在IBD中,肠道微生物群落失调导致促炎因子和毒素的产生,这些是有害物质,会损害肠道屏障的结构稳定性,从而加速疾病进展。因此,肠道微生物群的调节对于减轻与IBD相关的不良后果至关重要。鉴于肠道微生物群在维持体内平衡中不可或缺的作用及其与整体人类健康的错综复杂的联系,微生物群操纵预测的治疗方式,包括粪便微生物群移植、益生元和益生菌,已被越来越多地探索它们在改善IBD方面的潜力。大肠杆菌是肠道的早期定植者。然而,在IBD患者的肠道中,由于微生物菌群失调和免疫系统受损,大肠杆菌异常扩大定植的倾向以及大肠杆菌的突变,都会加剧IBD。临床上,抗生素通常用于抑制病原微生物的生长。然而,这不仅导致有益微生物的进一步减少和消耗,而且还会丰富病原体和大肠杆菌中抗生素耐药性的发展。共生微生物群在拮抗病原菌和改善IBD方面起积极作用。特别是,双歧杆菌和乳酸菌作为肠道微生物群的组成部分,已经研究了它们对阴性微生物的拮抗作用。

传统上,从庞大的微生物资源库中鉴定能够拮抗特定病原菌的益生菌需要大量的财政和人力投资。传统方法涉及益生菌和有害细菌在体内共培养,以及系统筛选具有靶向拮抗特性的潜在候选益生菌。最近,着重于微生物相互作用的研究将基于约束的基因组规模代谢建模定位为一种突出的自下而上的方法。通过整合基础研究,这种建模技术对微生物群中固有的未开发生物技术潜力进行了细致入微的探索。

在此,使用Cobrapy工具采用模拟来研究803种微生物物种在13个不同环境中与大肠杆菌的相互作用,从而促进菌株的精确筛选。值得注意的是,短双歧杆菌和动物双歧杆菌已成为具有拮抗大肠杆菌的巨大潜力的益生菌候选物,而乳酸菌表现出最小的拮抗作用。体外筛选确定粪便衍生菌株短双歧杆菌CCFM1369是最有效的大肠杆菌抑制剂。口服短双歧杆菌CCFM1369有效抑制肠杆菌科和大肠杆菌,同时提高抗炎微生物的丰度,尤其是Alistipes。此外,该菌株维持了肠道屏障的稳定性。值得注意的是,短芽孢杆菌CCFM1369通过降低葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠上皮细胞中的乳酸浓度来抑制大肠杆菌的传播,从而突出其对胃肠道环境中病原菌增殖的抑制作用。





Results
使用基因组规模代谢预测模型筛选拮抗大肠杆菌的益生菌
为了使用基因组规模代谢预测模型鉴定对大肠杆菌具有拮抗作用的益生菌,筛选了属于双歧杆菌属和乳酸杆菌属的益生菌。在本研究结果中,未发现乳酸菌属对大肠杆菌的任何拮抗作用。在双歧杆菌属中,动物双歧杆菌、短双歧杆菌、B. coryneformeB. ruminantiumB. stercoris能够拮抗大肠杆菌。最后,能够在高脂肪条件下拮抗大肠杆菌的益生菌包括动物双歧杆菌和短双歧杆菌(图1A)。进一步的交互评估确定了动物双歧杆菌、短双歧杆菌和大肠杆菌之间的关系是人类作用。

图1  在体外筛选和验证抑制大肠杆菌的益生菌

短双歧杆菌CCFM1369具有优异的大肠杆菌抑制能力
进行了抗菌试验,以在体外筛选对大肠杆菌具有拮抗作用的益生菌。从江南大学筛选出短双歧杆菌和动物双歧杆菌各5株,分别为CCFM 622、Bib6、Bib14、Bib9、Bib2、Bib11、Bia12、Bia5、Bia6、Bia11和Bia9,代表短双歧杆菌CCFM622、短双歧杆菌FZJHZ13、短双歧杆菌HuNan-2016、短双歧杆菌CJ1041、短双歧杆菌CJ951、短双歧杆菌JSWX39M4、动物双歧杆菌SDJN2M②1032、动物双歧杆菌FSDHZD8M6、动物双歧杆菌FFJNDD7M3、动物双歧杆菌AHWH4M1和动物双歧杆菌FBJHD4M6。正如预期的那样,嗜酸乳杆菌(La)FFJND6-L5和对照组对大肠杆菌几乎没有抑制活性。动物双歧杆菌和短双歧杆菌的抗菌活性相似(图1C;P<0.01)。最后,选择了抗菌活性最强的菌株Bib11,即短双歧杆菌CCFM1369,用于后续的功能验证和探索(图1B)。

短双歧杆菌CCFM1369减轻DSS诱导的小鼠结肠炎
短双歧杆菌CCFM1369干预结肠炎小鼠的实验图如下图2a所示。在DSS诱导的前7天,除对照组外,小鼠的体质量均表现出显著下降。以短双歧杆菌CCFM622为对照益生菌,抗菌活性较弱。短双歧杆菌CCFM1369和短双歧杆菌CCFM622处理7 d后,DSS处理小鼠的体质量显著增加,几乎达到对照组小鼠的体质量(图2B;P<0.01)。与对照组相比,DSS组小鼠的结肠更短,而短双歧杆菌CCFM1369和短双歧杆菌CCFM622改善了DSS引起的结肠缩短(图2C和F;P<0.01)。H&E染色用于确定结肠的组织学变化。对照组表现为完整的黏膜上皮,结肠组织有丰富的褶皱,黏膜下层肠腺分布密集,杯状细胞丰富。然而,在DSS诱导后也观察到结肠损伤。DSS导致肠组织溃疡;肠腺数量减少;结缔组织增殖增加(红色箭头);淋巴细胞、粒细胞和炎性细胞浸润(蓝色箭头)(图2D)。短双歧杆菌CCFM1369处理后,这些现象在相对清晰的组织条件下得到逆转。进一步评估了短双歧杆菌CCFM1369对屏障功能的影响。DSS暴露后,包括ZO-1、ZO-2和occludin在内的屏障功能基因在mRNA水平上显示显著降低,而短双歧杆菌CCFM1369处理显著增加了这三个基因mRNA水平(图2G-I;P<0.5)。使用PAS染色调查屏障功能损伤。与DSS组相比,短双歧杆菌CCFM1369显著恢复了屏障功能并维持了黏液层(图2)。为了验证短双歧杆菌CCFM1369对DSS诱导的肠道损伤的影响,使用免疫组化检查了结肠中ZO-1和occludin的表达。在DSS组中观察到ZO-1和occludin的荧光猝灭,而短双歧杆菌CCFM1369补充剂阻止了ZO-1和occludin的消失(2K)。

图2  补充短双歧杆菌CCFM1369减轻葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的C57BL/6J小鼠结肠炎症

短芽孢杆菌CCFM1369抑制肠杆菌科并调节肠道微生物组
肠道菌群在结肠炎中起着重要作用,假设短双歧杆菌CCFM1369通过影响肠道菌群来缓解结肠炎。16S rRNA测序用于确定DSS处理小鼠的微生物变化。DSS诱导或短双歧杆菌CCFM1369处理很少导致Chao1指数的变化,表明微生物群的丰度没有显著变化。然而,主坐标分析(PCoA)表明,对照组、DSS组和短双歧杆菌CCFM1369组这三组具有独特的微生物群谱,并且往往彼此相距较远(图3)。此外,在属水平上使用16SrRNA测序研究了目标微生物的丰度。DSS增加了Escherichia-Shigella的丰度,而短双歧杆菌CCFM1369显著抑制了它们的扩增(图3C;P<0.05)。同样,在DSS处理后也观察到肠杆菌科的丰度增加,这也显著降低了肠杆菌科的含量(图3E和F;P<0.01)。正如预期的那样,DSS诱导后双歧杆菌的丰度增加,大肠杆菌的丰度降低(图3D;P<0.01)。为了探索短双歧杆菌CCFM1369对其他微生物的影响,在属和门水平进行了微生物分析。与对照组相比,DSS显著降低变形菌门水平,增加拟杆菌门和厚壁菌门水平。短双歧杆菌治疗CCFM1369逆转了这些异常(图3G,P<0.05)。在属水平上,DSS组Alistipes的丰度较低,而BacteroidesOdoribacter的丰度较高,说明短双歧杆菌CCFM1369促进Alistipes并抑制BacteroidesOdoribacter(图3H,P<0.05)。

图3  在DSS处理的小鼠中,短双歧杆菌CCFM1369处理7 d后微生物组的改变

短双歧杆菌CCFM1369降低管腔乳糖水平以抵抗大肠杆菌在Caco-2中的定植
为了进一步探索短双歧杆菌CCFM1369抑制大肠杆菌的机制,进行了结肠代谢组学分析。筛选后,收集了阳性和阴性模式的代谢物,检测到195种代谢物。对潜在结构的稀疏预测显示,DSS和短双歧杆菌CCFM1369显著影响结肠代谢组学特征(图4)。进一步选择了变量重要性投影值大于1的代谢物,并对其进行了统计分析。最终,观察到5-羟基吲哚-3-乙酸和乳酸水平的显著变化。DSS引起的肠道损伤导致这两种代谢物的丰度急剧增加,而短双歧杆菌CCFM1369降低它们的水平(图4B和C;P<0.05)。测量了结肠中的丁酸含量。DSS和短双歧杆菌CCFM1369均诱导丁酸水平降低(图4E;P<0.05)。对乳酸和丁酸与具有显著变化的代谢物进行了相关性分析。正如预期的那样,丁酸与大肠杆菌和双歧杆菌呈显著关系(图4D)。

图4  短双歧杆菌CCFM1369在DSS处理的小鼠中治疗7 d后诱导了对大肠杆菌和肠杆菌科的不利环境

短芽孢杆菌CCFM1369通过向肠上皮细胞输送丁酸来降低乳酸的含量
评估了小鼠肠道中与乳酸分泌相关的基因的mRNA水平。DSS增加Ldha表达水平,而短双歧杆菌CCFM1369降低Ldha表达水平。同样,短双歧杆菌CCFM1369对HIF-2α基因表达的较低值有显著影响(图5A和B;P<0.01)。此外,测定了短双歧杆菌CCFM1369的定植能力,发现短双歧杆菌CCFM1369定植率分别为(28±0.04)%。为了确定短双歧杆菌CCFM1369是否影响肠上皮细胞中的乳酸分泌,将短双歧杆菌CCFM1369与CaCO-2细胞和3% DSS共培养(图5C和D,P<0.01)。短双歧杆菌CCFM1369乳酸产量减少,可能是因为它的数量从108到105 CFU/mL,而Caco-2细胞产生的含量最高(图5E;P<0.01)。随着DSS的暴露,Caco-2细胞发生细胞死亡,导致肠腔内乳酸分泌减少(图5F;P<0.01)。短双歧杆菌CCFM1369的干预进一步导致Caco-2细胞上清液中乳酸含量降低,乳酸分泌相关基因Ldha下调(图5H;P<0.01)。短双歧杆菌与DSS组相比,CCFM1369还降低了HIF-2α的mRNA表达(图5G)。

图5  短双歧杆菌CCFM1369降低DSS处理的小鼠和细胞中的乳酸水平

图6  短双歧杆菌CCFM1369对结肠炎的影响机制





Conclusion
本研究利用基因组规模的代谢预测模型来识别对大肠杆菌具有拮抗作用的益生菌。鉴定出的益生菌包括短双歧杆菌和动物双歧杆菌,而乳酸杆菌菌株没有显示出拮抗大肠杆菌的潜力。使用体外筛选模型,发现短双歧杆菌CCFM1369具有最有效的拮抗作用,并抑制DSS诱导的小鼠中肠杆菌科和大肠杆菌的扩增。DSS处理后差异代谢物乳酸水平显著升高,而短双歧杆菌CCFM1369分泌丁酸并抑制LdhaHIF-2α的表达,促进肠上皮细胞代谢转移,抑制乳酸水平升高。


Bifidobacterium breve modulates lactic acid to curtail Escherichia coli expansion and alleviate inflammatory bowel disease

Xiaoxiang Gaoa,b, Yuxuan Xiaa,b, Xiaoxuan Suna,b, Wenxuan Doua,b, Ruimin Chena,b, Pan Huanga,b, Leilei Yua,b, Fengwei Tiana,b, Jianxin Zhaoa,b, Wei Chena,b,c, Qixiao Zhaia,b,*

a State Key Laboratory of Food Science and Resources, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu, 214122, PR China

b School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu, 214122, PR China

c National Engineering Research Center for Functional Food, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu, 214122, PR China

*Corresponding author.


Abstract

Inhibition of the abnormal proliferation of Escherichia coli is crucial for alleviating inflammatory bowel disease. Due to the complexity of the gut microbiota, specifically targeting and inhibiting particular microbes is a challenging task. One approach involves screening for probiotics that antagonize E. coli; however, this process often requires extensive in vitro experiments using a vast pool of probiotics. In this study, we employed a genome-scale metabolic prediction model to predict the interactions between 803 strains of microbes and E. coli. The results indicated that Bifidobacterium breve and Bifidobacterium animalis exhibited the most potent inhibitory effects. In vitro antibacterial assays and mouse experiments validated the inhibitory efficacy of B. breve CCFM1369. Additionally, B. breve CCFM1369 demonstrated the ability to inhibit key gene Ldha and HIF-2α and reduce the luminal lactate concentration, thereby diminishing the colonization capacity of E. coli. These findings support the potential application of B. breve in the alleviation of colitis. 

Reference:

GAO X X, XIA Y X, SUN X X, et al. Bifidobacterium breve modulates lactic acid to curtail Escherichia coli expansion and alleviate inflammatory bowel disease[J]. Food Bioscience, 2024, 61: 104626. DOI:10.1016/j.fbio.2024.104626.

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