文章来源于诊断科学，作者
定量聚合酶链反应（qPCR；也被称为实时PCR）是一种基于PCR的分子生物学技术，能够对目标基因进行扩增和定量[1]。由于其简单、相对较低的成本和灵活性，qPCR已经在多个学科中找到了许多应用。
在研究实验室环境中，qPCR被用于基因转录分析、研究microRNA和检测转化细胞系中的突变基因。在公共卫生领域，qPCR可用于监测水和食品安全[2, 3]。PCR还可用于诊断医学，以确定传染病和非传染病的病例，确定与疾病有关的新基因，监测和追踪疾病爆发，并对癌症患者进行表型分析[4, 5, 6]。
qPCR使用DNA作为模板，而反转录qPCR（RT-qPCR）使用来自RNA的互补（cDNA）模板。qPCR的结果可以是定性的（确定目标序列是否存在）或定量的（提供目标序列的拷贝数）。专门的qPCR热循环仪与荧光仪相配合，检测目标扩增过程中染料释放的荧光，然后这些荧光读数可用于定量。除了定量能力外，qPCR相对于PCR的一个重要优势是能够评估结果，而不需要凝胶电泳。
qPCR的广泛应用使其成为一项需要完善的重要技术。本章提供了一些必要的提示，以确保你的所有qPCR实验有准确和可重复的结果。
试剂
正确储存引物
你的qPCR反应取决于正在使用的引物的稳定性。将引物母液储存在焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中会导致引物降解，因为其pH值呈微酸性。使用中性pH值的溶液将保护你的引物不被降解。
无核酸酶的水或三乙胺四乙酸（EDTA）（TE）缓冲液（10mM三，0.1mM EDTA）是储存引物的好选择，将使你的引物保持坚固和完整。
同时，确保引物储存在-20℃的冷冻室中。
将引物等分
从原液中制备工作原液引物可谓一石二鸟：限制冻/融循环，并有助于防止原液污染。反复冷冻/解冻会导致引物降解，所以要制作工作原液保存在冰箱里，以便进行qPCR实验。将母液在TE缓冲液中（如上）稀释为10-20 μM通常是一个好的经验。
准备工作原液的等分量也限制了它们被冷冻/解冻的次数。用移液器反复浸泡母液，会增加污染的机会，所以利用工作母液进行实验有助于减少这种风险。在发生污染的情况下，只需要制作一个新的工作母液就比购买一个全新的引物要好得多。
将反应酶放在冰上
如果你使用的酶是热敏性的，确保你在准备反应混合物时将其放在冰上。在室温下使用这些酶会导致非特异性扩增或次优性能。如果可以的话，把酶放在冰箱里，在除模板外的所有其他成分都加入后再把它们加入反应混合物中。这将有助于减少反应中酶的降解和非特异性扩增。
试剂需要充分混合
一旦解冻，你的qPCR试剂很可能不再彻底和均匀地混合。为了解决这个问题，在将引物加入反应混合物之前，涡旋引物。对于其他需要更小心处理的试剂或样品，如酶，可以轻轻地倒置它们或轻弹试管。
你也可以短暂地旋转它们，以帮助确保所有试管中的内容被彻底混合。一旦所有的成分都被添加到试管中，通过移液器上下几次将它们充分混合。这将确保每个反应都得到相同数量的每个成分。
样品/模板
使用高质量的模板进行反应
无论你是进行qPCR还是RT-qPCR，你的模板都需要有很高的质量，以便从你的实验中获得最佳结果。在建立反应之前，确定你的模板的浓度和纯度。对于DNA、cDNA或RNA来说，可以利用紫外-可见光（UV-Vis）分光光度计来实现这一点。将这些测量结果记录下来，以便于你参考。
加入最佳浓度的模板
qPCR是一种非常灵敏的技术，因此使用最佳数量的模板是产生准确测量的必要条件。模板太少会导致扩增不足，模板太多会导致聚合酶被抑制。
在进行量化的地方，超出实验标准的线性范围的扩增也会导致不准确的量化值。你的样品应该在循环20-30之间越过循环阈值。在第30个周期后越过阈值的样品表明没有足够的模板存在而被扩增。如果样品在第20个周期前越过阈值，说明反应中使用了太多的模板，应该进行稀释。
执行标准曲线，找到最佳的模板浓度，使其在20-30个周期之间进行扩增，是防止这个问题的一个好方法。
在某些情况下，可能无法添加最佳数量的模板，如在传染病诊断中对未净化的样品。对于在扩增过程早期出现的强阳性样品，结果可能是毫无疑问的。但对于晚期（30周期后）出现的弱阳性，重新取样或重新检测可能是明智的，这取决于你的具体检测或组织方案。
正确储存和准备稀释液
核酸会吸附在储存核酸的试管边上，导致样品随时间流失。为了帮助防止这种情况，你可以将你的样品和稀释液储存在不易引起吸附的塑料管中，如聚甲醛。如果可能的话，在做qPCR实验的当天就把任何需要的样品稀释液配好。
如果没有，最好在建立反应前仔细检查稀释液的浓度，以确保浓度仍然是它们应该有的样子。最后，在试管上贴好标签，以便你和实验室里的其他人知道每个试管里有什么样品或稀释液。
质量控制
避免实验室环境中的污染
毁掉你的qPCR实验的最快方法之一是引入污染。你可以采取一些措施来避免这个问题。在准备反应之前，用能消除DNA的溶液（如10%的漂白剂溶液）擦拭桌面、移液器、架子和任何其他设备或表面。始终准备你的反应混合物，使你的模板是最后加入到反应中的成分。
当你加入模板时，如果可能的话，在与你准备初始混合液的地方分开的工作台进行——这样做将防止模板在你的试剂库中的交叉污染。在这些准备工作之间，最好也能更换手套，有专用的实验服和设备。虽然看起来很麻烦，但采取这些步骤可以帮助防止污染，最终节省你的时间和金钱。
适当的移液器使用有助于准确性和可重复性
使用经过校准的适当体积的移液器将有助于以后量化时的准确性。高容量移液器（P200和P1000）对制作母液很有用，而低容量移液器（P2或P10）对添加模板和制备标准曲线更有用。
正确使用移液器有助于确保复制之间的可重复性，并减少交叉污染的风险。在你开始设置反应之前，一定要检查你的移液器是否准确，并定期校准它们。使用过滤的吸头也可以帮助减少污染的可能性。
利用实验的对照
在解释你的qPCR数据时，至关重要的是要有正确的对照，以证明检测到的荧光信号实际上是代表目标的，‘阴性’孔中没有信号并不是由于实验失败所致。
对于你设置的每个反应，一定要确保你有以下的对照：无模板对照（NTC），阴性对照和阳性对照。NTC对照将有助于检测试剂的污染，并排除引物二聚体。该对照包含所有的反应成分，除了用无核酸酶水代替的模板。
阴性对照将包含缺乏目标序列的模板，有助于评估所选引物的特异性。阳性对照将包含一个已知能成功扩增的目标序列。该对照可以检测PCR抑制剂的存在，并证明目标序列的缺失是否是由于整体扩增失败造成的。
当进行相对定量时，需要一个内源性的对照来对所有的孔进行标准化。为此，通常利用内源性基因的扩增。
仔细检查循环程序
在你所有的努力工作之后，你最不希望的是热循环仪被设置为错误的循环条件。在仪器上设置并保存一个模板文件，可以防止每次运行反应时错误地进入
每次运行反应时的程序错误。根据过去的运行情况或你的实验书仔细检查程序条件以确定。
方案使用要一致
一旦建立了一个方案，包括使用的引物、加入反应中的模板浓度和循环程序，请确保你遵守相同的方案，以确保未来实验的可重复性，不仅为你自己，也为实验室的其他成员。如果一个方案是有效的，并给出了可重复的结果，那么就没有必要重新发明轮子！
文章来源于诊断科学，作者
