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文章来源于分子庄园，作者木子庄主
蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定，即氨基酸的线性排列顺序。蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸排列顺序，它是蛋白质生物功能的基础。蛋白质测序的主要策略是采用化学或者酶消化方法将多肽链拆分，然后测定氨基酸残基含量和组成。几乎所有的蛋白合成都起始于N-端，目前对蛋白N端测序主要分类两大类，其一为非质谱技术，例如经典的Edman降解法、其二为质谱技术。由多条多肽链组成的蛋白质分子 ，必须先进行拆分。拆开后的肽链可用层析或电泳进行分离。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。过甲酸氧化法的原理是利用过氧化氢和甲酸来氧化二硫键中的硫原子，使其断裂形成两个硫氧化物。 不可逆、-CH2SO3H这种方法可以在中性或弱碱性条件下进行，不会对蛋白质结构产生影响。[ β-巯基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等，不可逆、-S-CH2-COOH可逆、-R1-S-S-R2 + HSO3-R1-S- + R2-S-SOH3通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。4）测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法)，C末端分析法(肼解法；酶降解法；硼氢化锂法)。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。2.胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：Phe;Trp;Tyr——C端【PH=8~9】5.胃蛋白酶：Phe;Trp;Tyr;Val——N端【PH=2】利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。
α-氨基可与DNFB反应，形成黄色的DNP-氨基酸，可用非极性溶剂提取后用纸层析法分离，与标准DNP-氨基酸比对来确定氨基酸种类。该试剂也被用于鉴定蛋白质N端氨基酸，即Sanger法。肽段N端氨基酸有游离的α-氨基，可以与DNFB反应得到DNP-肽。由于DNFB与氨基结合牢固，不易水解，故当DNP-肽完全水解后，N端的氨基酸就成为DNP-氨基酸。由于DNP-氨基酸溶于乙酸乙酯和乙醚等有机溶剂，故可用这两种试剂进行色谱（纸层析）分析，与标准的DNP-氨基酸作为对照，就可鉴定出是何种氨基酸。既然可以测定蛋白质N端的序列了，那么，如果用酶将蛋白质打断为更多的小肽，产生更多的α-氨基，就可以得到更多序列信息了。许多酶可以特异断裂某些氨基酸C端或N端的肽键，如胰蛋白酶(Trypsin)可以特异性断裂Lys、Arg的C端肽键，糜蛋白酶(Chymotrypsin)可以特异性断裂芳香族氨基酸C端肽键等。有了DNP-氨基酸和酶的切点提供的序列信息，就可以像拼拼图一样将测得的序列信息拼接起来，最终得到完整的氨基酸序列。b.利用尿素、盐酸胍、极端PH、高盐等拆分肽链，使蛋白质各亚基分离。c.用DTT、过甲酸等打开二硫键，保证所有肽链都为单链。d.将单链完全水解为氨基酸，分析氨基酸组成(后续测得序列中各种氨基酸含量应与该步骤得到的数据吻合)。e.用DNFB、羧肽酶等测定单链N/C端氨基酸组成。f.用酶、CNBr(溴化氰)等将肽链切割成小片段，再测定每个小片段的序列。Edman降解法(Edman degradation)，和Sanger法相似，该方法也是通过一种芳香族化合物-异硫氰酸苯酯(PITC)与蛋白质N端氨基酸结合。但与DNFB不同的是，PITC可以使得与之结合的N端氨基酸环化，进一步生成苯乙内酰硫脲氨基酸(PTH)衍生物，导致N端氨基酸从肽链上自发解离下来。该方法逐一地从蛋白质或肽的N端去除氨基酸，并识别每一步去除的氨基酸。该方法可以连续测定20-30个氨基酸，但对于长链蛋白质，可能需要结合其他方法。 这种方法真正地实现了蛋白测序的自动化——只需让N端的氨基酸残基依次变成PTH-氨基酸掉落，再依次检测PTH-氨基酸的种类即可。据此，也诞生了以Edman降解法为原理的氨基酸自动测序仪。虽然Edman降解法仅适用于20-30个AA长度的小肽，超过50AA后就极不准确，但用来测定将肽链酶解后各个小片段的序列还是十分准确高效的。质谱分析已成为蛋白质测序的强大工具，它利用蛋白质或肽的质量和电荷特性，通过质谱仪进行分析，以确定其氨基酸组成。通过碰撞将肽段打断为带电片段，通过分析带电片段在电场、磁场中的运动轨迹得到其荷质比，经与数据库对比、计算后得到对应序列。b.将肽段离子化、气态化后进行一级质谱，记录所有肽段在一级质谱(MS1)中的质荷比(m/z)及丰度。c.从一级质谱中选择特定片段作为母离子，使之进入质谱仪的碰撞池与惰性气体分子碰撞后，化学键断裂(大部分为酰胺键断裂)，形成多种子离子(一般为酰胺键断裂形成的b/y型离子)。d.子离子进入二级质谱(MS2)，记录所有子离子在二级质谱中的质荷比及丰度。e.将得到的质谱结果与数据库进行对比，测定各种片段的序列，并进行拼接。并且，结合液滴微流控以及抗体标记技术，质谱也可应用于单细胞蛋白质组的研究，同时检测单个细胞中数以千计的蛋白种类与丰度。如单细胞质谱流式技术(CyTOF)。除此之外，质谱也可与高效液相色谱等技术联用，对细胞组分进行高通量检测。基于NGS的方法，如RNA-seq和核糖体分析，可以通过分析相应的mRNA序列来间接推断蛋白质序列。NGS提供了高通量能力，但依赖于mRNA数据，无法提供直接的蛋白质序列信息。声明：本微信注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢。
