研究背景
结核病（Tuberculosis，又称TB）为结核杆菌（分枝杆菌属）感染引起的疾病。结核通常造成肺部感染，也会感染身体的其他部分[1]。大多数感染者没有症状，此型态感染称为潜伏结核感染。如果此时没有适当治疗，10%的潜伏感染患者会恶化为开放性结核病（Active tuberculosis），致死率为 50%。结核病的典型症状包含慢性咳嗽、咳血、发烧、夜间潮热，以及体重减轻。感染其他器官则可能导致其他症状。结核病属于由开放性结核患者经空气传播的人兽共患的传染病，而潜伏性结核病患者则不会散布疾病。据世界卫生组织统计，全球有1060万 结核病患，87%分布在发展中国家[2]。
Nature Communication杂志在今年初发表了由来自荷兰，德国，英国和印度团队300BCG项目的最新研究成果[4]。接种卡介苗可在不同人群和个体中诱导不同程度的抗菌感染保护，但其背后的机理仍不清楚。因此，科研人员在结核病低流行国家（荷兰）研究了接种卡介疫苗前后外周血单核细胞（PBMCs，含自体血清）控制卡介苗生长的能力，以此来衡量功能性抗菌反应。在此研究项目中，为了确定影响结核杆菌生长控制的不同因素，项目研究了接种卡介疫苗对健康荷兰成年人的影响，利用Olink Target 96 Inflammation Panel及RNA单细胞测序进一步揭示卡介苗获得性免疫机理, 证明卡介疫苗接种引起的后天结核杆菌生长抑制能力与卡介苗接种前就存在的生长抑制能力不同。
研究队列
荷兰300BCG健康人群队列
300BCG队列包括325名西欧血统的健康成年志愿者，在左上臂皮内注射0.1毫升卡介苗（保加利亚卡介苗，InterVax）。卡介苗接种3个月后，采集血液样本。参与者之前未接种过任何卡介苗，在加入本研究之前的 3 个月内或研究期间也未接种过任何其他疫苗，在研究开始前 4 周内报告发烧的参与者被排除在外。本研究对队列中42名（女性20名，男性22名）参与者进行了详细分析，参与者筛选条件为 21 名在卡介苗接种后对金黄色葡萄球菌（SA）刺激反应良好者和 21 名反应不佳者。IL-1β 为训练免疫的生物标志物，分别在基线和 3 个月时采集样本。
志愿者均确认在出生时接种过卡介疫苗并通过结核杆菌感染筛查，志愿者可选择接种卡介苗（BCG-RV，n = 35）或不接种对照组（BCG-NRV，n = 31）。卡介苗（TUBERVACTM）。在接种卡介苗后的第 0 天（T0）、第 1 天（T1）和第 10-12 周（T2）采集受试者血液。成功获取了 58 名受试者的数据。
研究结果
卡介疫苗接种前后的分歧杆菌生长抑制
荷兰300BCG健康人群队列的42 名参与者中有 11 人（26%）在接种卡介苗前已经抑制了卡介苗生长（定义为与接种体相比，CFU 减少 50%）。在其余的参与者中，31 人中有 8 人（26%）在接种卡介疫苗 3 个月后获得了抑制卡介苗生长的能力（定义为 ΔlogCFU (post (V3) - pre (V1))<-0.17，即平均接种量的 SD 值）。相比之下，42 名原始志愿者中有 23 人（占总数的 54%）在接种卡介疫苗前或接种后 3 个月都无法抑制卡介苗的生长（图 1）。依据此结果，参与者被分为三个功能组：已有抑制(already controlling)、获得性抑制 (acquired control)、无抑制(No control)。值得注意的是，已有抑制组的 11 人中有 9 人（81%）是女性，获得性抑制的 8 人中有 4 人（50%）也是女性，而无抑制的 23 人中只有 7 人（30%）是女性。研究表明控制卡介苗生长的能力与对金黄色葡萄球菌的原始 IL-1β 反应无关，也与疫苗接种的免疫学参数无关，不同组的 IL-1β 反应没有明显差异。
图1. 卡介苗诱导功能性效应。
在卡介苗体外刺激 96 小时后产生的细胞因子和趋化因子在三个功能组有明显差异。已有抑制组中，CCL17、CCL1、IL-4、CCL27 和 CX3CL1 的相对产量较高。有趣的是，这些浓度在获得性抑制组中个体接种疫苗后并没有增加，这表明体外卡介苗刺激激活了不同的、非重叠的免疫途径。在卡介苗刺激下，已有抑制组和获得性抑制组的 CCL21 和 CCL25（这两种趋化因子都与炎症性疾病有关）浓度相对较低。在未受刺激的血浆中，已有抑制组CCL25 也较低。以前也曾发现接种前男性的 CCL25 比女性高，这与发现的女性在已有抑制组的比例增加相一致。
图2. 细胞因子/趋化因子蛋白血浆图谱
在来自印度班加罗尔的完全独立卡介疫苗再次接种队列，我们发现了非常相似的规律，证实了欧洲300BCG 队列得出的数据及结论。本队列中卡介苗的初次接种是在出生后直接进行的，参与者在研究进行时，平均年龄 20.2 岁，18-24 岁不等。在纳入研究的时间点，所有参与者的 IGRA 均为阴性。参与者接种了俄罗斯卡介苗作为卡介苗再接种疫苗，在 12 小时的全血刺激中，IFN-γ 对卡介苗的反应被用来衡量接种疫苗的效果。与接种前相比，接种后 10-12 周抽取的样本中 IFN-γ+ CD4+ T 细胞的数量显著增加。已有抑制组的已经控制 T 细胞数量与无抑制有所增加。获得性抑制组中，CD56hi NK 细胞的频率降低，反映了已有抑制组中 NK 细胞的低活化程度。这些来自荷兰初次接种队列和印度卡介苗再接种队列的数据共同表明，与卡介苗（再）接种时的获得性抑制组相比，已有抑制组具有不同的特征。
图3.不同功能组之间单核细胞的对比分析
在之前的分析中，和无抑制组和已有抑制组在与免疫基因表达谱上存在差异。获得性抑制组和已有抑制则主要表现为单核细胞基因表达的差异。对代谢途径分析表明，已有抑制组表达了与氧化磷酸化和线粒体功能障碍相关的基因，而获得性抑制组则表达了更高水平的与糖酵解相关的基因，及参与丙酮酸发酵成乳酸的基因，这种现象被称为沃伯格效应。与这些发现一致的是，已有抑制组中的sirtuin通路上调，而在获得性抑制组中，HIF-1α信号转导增加。因此，两者代谢在调节是相反的，已有抑制组中中氧化磷酸化最主要，获得性抑制组中糖酵解最主要。
此前的多项研究表明[5-8]，卡介苗除了对结核病有部分保护作用外，还可以降低儿童整体死亡率，这很可能是由于卡介苗在婴幼期对多种病原体具有同源保护作用。在可控的实验感染条件下，接种卡介苗可增强成人对异源病毒（黄热病）保护，并可调节对实验性恶性疟原虫感染的反应，使炎症反应更早、更强。接种卡介苗还能增强对随后接种疫苗的免疫反应，包括对 SARS-CoV 的免疫反应。形成这些异源保护的可能机制目前仍没有完整的解释。因而在广泛使用一个世纪后的今天，对BCG疫苗免疫反应机理进行更深入的分子层面的蛋白质结合基因组学的多组学研究，对更广层面疫苗的研发以及传染性疾病的防治，有非常重要意义。
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