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摘要：肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）富含木脂素、新木脂素和二芳基壬烷类化合物，这些化合物已被充分证实具有抗炎特性。然而，关于二芳基壬烷类化合物、新木脂素、单萜类化合物等的结合形式及其抗炎作用的研究却很少。本研究分离得到了33种新化合物（2-7、9-22和41-52），其中包括两种新木脂素，以及多种新木脂素-二芳基壬烷类、丙烯基苯-二芳基壬烷类、2,3-二甲基丁烷型木脂素-二芳基壬烷类和单萜-二芳基壬烷类结合物，同时还得到了先前已报道的化合物（1、8和23-40）。这些化合物的化学结构通过光谱分析得以确定。化合物2、4、9、11、12、14、17和18对TLR激动剂诱导的NF-κB/AP1和IRF信号传导表现出强烈的抑制作用。值得注意的是，立体异构体表现出不同的活性，其中10R,11R-异构体具有细胞毒性，而10S,11R-异构体则产生相反的效果，特别是在第一组化合物中。
■ 引言
肉豆蔻（学名：M. fragrans）是一种常绿热带植物，以其宜人的香气和风味而闻名。它在印度尼西亚、泰国等东南亚国家，以及日本、中国等东亚国家，还有南非和印度被广泛种植以供经济之用。1肉豆蔻植物主要有三种商业产品：肉豆蔻衣（mace）、肉豆蔻（种子）和精油，这些产品被广泛用作食品中的香料。2该植物的多个部位已被用于传统医学，如肉豆蔻衣在中国传统医学中用于治疗胃病，并可能具有堕胎作用。3在阿育吠陀医学中，肉豆蔻衣用于治疗哮喘和胃肠道疾病。4肉豆蔻有着悠久的药用历史，可用于治疗腹泻、风湿病、头痛以及增进食欲。肉豆蔻油则因其防腐和镇痛特性而被用于治疗风湿病、肠道疾病和肾脏相关问题。1
肉豆蔻含有多种植物化合物，如木脂素、新木脂素、二苯基烷烃、苯丙烷类、萜类、烷烃、脂肪酸和脂肪酸酯，以及一些次要成分，如类固醇、皂苷、三萜类和黄酮类。5-9这些化合物存在于植物的不同部位，如肉豆蔻衣（mace）、肉豆蔻（种子）、茎皮和果实果皮中，据报道具有药理作用，如抗炎和镇痛活性，10,11抗氧化活性，8抗菌和抗真菌活性，12以及抗癌和化学预防活性，13这表明肉豆蔻具有潜在的药用价值。
二芳基壬烷类、木脂素和新木脂素是从肉豆蔻中鉴定出的关键代谢产物，其抗炎活性已有文献记载。14-18然而，关于二芳基壬烷类、新木脂素、单萜类和其他化合物的结合形式以及它们的抗炎特性的信息却有限。在本研究中，我们从肉豆蔻种子中分离出了多种新木脂素-二芳基壬烷类、2,3-二甲基丁烷型木脂素-二芳基壬烷类、丙烯基苯-二芳基壬烷类和罕见的单萜-二芳基壬烷类结合物。我们研究了其中一些化合物对NF-κB/AP1和IRF活性的影响，以及它们在调节促炎细胞因子和一氧化氮产生中的作用。
■ 结果与讨论
利用对肉豆蔻75%乙醇提取物进行的重复柱色谱法，我们鉴定并分离出了一种新的二氢苯并呋喃新木脂素（20）、一种新的1,4-苯并二氧六环新木脂素（49）和31种新的二芳基壬烷类衍生物（2-7、9-19、21、22、41-48和50-52），以及已知化合物（1、8和23-40）（图S.36）。本研究中分离的化合物（1-19、21-22、41-48和50-52）根据结构部分2在结构部分1中的取代方式以及部分2的特定性质，被分为六组（I-VI）（见图表1，图S.51-S.53）。在本文中，我们为每组中的一种代表性化合物提供了结构测定结果，其他化合物的结构测定结果可在支持信息中找到。
Myricone A（1）也被称为myrifragranone B19，是一种黄色树胶，分子式为C42H50O10，在正离子HRESIMS中，由m/z 737.3302 [M + Na]+的离子峰得出（计算值：C42H50O10Na，737.3302）。对于部分1，NMR光谱显示了不对称1,2,3,6-四取代苯环[δH 7.20（1H, d, J = 8.5 Hz, H-4′）和6.46（1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′）]、一组1,3,4-三取代苯环[δH 6.69（1H, d, J = 2.0 Hz, H-2″）, 6.77（1H, d, J = 8.0 Hz, H-5″）和6.59（1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-6″）]、含有八个亚甲基的烷基链（其中一个邻接羰基[δH 3.18（2H, m, H-2），δC 45.17]，一个苄基[δH 2.46（2H, t, J = 7.6 Hz, H-9），δC 35.11]，以及其他六个[δH 1.68（2H, p, J = 7.4 Hz, H-3），δC 24.64；δH 1.53（2H, p, J = 7.2 Hz, H-8），δC 31.35；δH 1.22-1.37（8H, m, H-4-7）]）和一个羰基（δC 209.44）。通过分析HMBC光谱（图1），确定了两个芳香环通过烷基链和羰基相连的关系。部分2的1H NMR光谱包含一组1,3,4-三取代苯环的特征共振[δH 6.89（1H, s, H-2′′′）和6.87（2H, s, H-5′′′,6′′′）]、三个甲氧基[δH 3.80（3H, s, H-16）和3.73（6H, s, H-17,18）]、一个甲基[δH 1.17（3H, d, J = 6.1 Hz, H-12）]、两个次甲基[δH 4.21（1H, d, J = 6.5 Hz, H-10），5.30（1H, p, J = 6.2 Hz, H-11）]和一个单取代烯烃[δH 5.13（2H, m, H-15），5.96（1H, ddt, J = 16.9, 10.2, 6.7 Hz, H-14）]。根据HMBC交叉峰（图1），确定了两个苯环之间连接有一个丙基部分和一个烯丙基部分。甲氧基的位置通过HMBC相关性和NOESY实验（图1）进行表征。最后，通过H-10与C-2′和C-4′的HBMC交叉峰（图1）确认了部分1通过C-10和C-3′与部分2相连。当使用氘代氯仿作为溶剂获取1的1H NMR光谱数据时，质子H-2′′′、H-5′′′和H-6′′′无法区分，并在化学位移6.89（1H）和6.87 ppm（2H）处出现两个单峰。由于这些信号之间没有耦合，且H-5′′′和H-6′′′的化学位移相同，这可能导致错误地将其识别为1,3,5-三取代苯环，而非1,3,4-三取代苯环，如文献所述。20,21为了验证结构，我们使用丙酮-d6作为溶剂获得了1的额外NMR光谱，这使得所有芳香质子都能被区分开来（表S.11）。综合使用一维和二维NMR（COSY、HSQC、HMBC和NOESY）技术，我们为1分配了所有的1H和13C信号（表1）。此外，我们还确定了1的平面结构，与Oanh等人报道的myrifragranone B的平面结构一致。19然而，由于H-10和H-12之间的空间接近性，先前报告中通过H-10和H-12之间的NOESY相关性来确定1的相对构型为苏式（threo-form）的方法被发现是错误的。这进一步得到了证明，因为在2（赤式，erythro-form）中也观察到了H-10和H-12之间的NOESY相关性。接下来，我们使用Maestro 10.6对1所有可能的相对构型的耦合常数进行预测，以确定1的相对构型。H-10和H-11质子之间的预测J值（J10-11 = 5.0 Hz，图S.42）与观察到的实验值（J10-11 = 6.5 Hz，表1）非常吻合。因此，1的相对构型被确定为苏式。这一发现与先前使用CDCl3中的大或小耦合常数来确定相对构型的研究结果一致。22,23, 1的绝对构型是基于ECD光谱证据确定的。实验ECD光谱与简化后1的10R,11R-构型的计算光谱非常吻合（图S.43）。基于上述证据，1的结构如图表1所示。
Myricone K（10）为淡黄色树胶状物，根据正离子高分辨电喷雾质谱（HRESIMS）中m/z 737.3301 [M + Na]+的离子峰，确定其分子式为C42H50O10（计算值：C42H50O10Na，737.3302）。与I组化合物类似，10的1H和13C NMR数据显示存在一个二苯壬烷类基团（部分1）和两个苯丙基团（部分2）（表S.3和S.4）。然而，10的部分1通过C-10和C-3″之间的氧原子与部分2相连，这由H-10（δH 5.19）与C-3″（δC 146.66）之间的HMBC交叉峰所证实（图1）。10中H-10（δH 5.19）和C-10（δC 86.04）的化学位移向低场移动，表明其与氧原子相连，而非苯环。根据1H NMR谱中观察到的J10−11偶合常数较小（2.7 Hz）（图S.42），确定10的相对构型为赤式。此外，将实验电子圆二色谱（ECD）与简化后10的10R,11S-构型的计算谱图进行比较（图S.44），发现两者非常相似，这为10的结构提供了确凿证据，如图表1所示。
Myricone O（14）为淡黄色树胶状物，根据正离子HRESIMS中m/z 707.3196 [M + Na]+的离子峰，确定其分子式为C41H48O9（计算值：C41H48O9Na，707.3196）。14的1H和13C NMR数据显示存在一个二苯壬烷类部分（部分1），与I组和II组化合物类似。然而，14被发现含有一个2,3-二甲基丁烷型木脂素单元（部分2），而非两个苯丙基团。此外，14中2,3-二甲基丁烷型木脂素单元的信号与myristargenol A的信号相似（表1）。24这种相似性通过观察到两组1,3,4-三取代苯环的信号得到验证，包括[δH 6.68（1H, d, J = 1.9 Hz, H-2′′′）, 6.79（1H, d, J = 8.2 Hz, H-5′′′）, 和6.65（1H, dd, J = 8.1, 1.9 Hz, H-6′′′）]和[δH 6.55（1H, m, H-2‴′）, 6.75（1H, d, J = 7.7 Hz, H-5‴′）, 和6.53（1H, m, H-6‴′）]，两个甲基[δH 0.74（3H, d, J = 6.7 Hz, H-14）和0.85（3H, d, J = 6.8 Hz, H-15）]，三个次甲基[δH 4.18（1H, d, J = 11.9 Hz, H-10）, 2.26（1H, m, H-11）, 和1.84（1H, m, H-12）]，一个亚甲基[δH 2.47（2H, m, H-13）]，一个甲氧基[δH 3.79（3H, s, H-17）]，以及一个亚甲二氧基[δH 5.95（2H, s, H-16）]。C-10和C-3′之间的连接由H-10（δH 4.18）与C-2′（δC 161.51）和C-4′（δC 134.08）之间的HMBC交叉峰所证实，从而确定了部分2和部分1之间的相关性（图1）。分子的相对刚性归因于H-10和H-11之间的反平面排列，这是通过应用Karplus方程对偶合常数（J = 11.9 Hz）分析得出的。25H-11和H-12之间的偶合常数最初通过NMR模拟预测为约2.5 Hz（图S.37），并通过选择性同核去耦1H NMR实验进一步确定为2.2 Hz（图S.38），表明H-11和H-12之间存在邻位交错相关。因此，基于NOESY数据（图S.38），提出14的相对构型为rel-10S,11R,12S。最后，通过比较计算和实验ECD谱图（图S.45）确定了14的绝对构型，14的结构如图表1所示。
Myricone Q（17）为淡黄色树胶状物，根据正离子HRESIMS中m/z 705.3040 [M + Na]+的离子峰，确定其分子式为C41H46O9（计算值：C41H46O9Na，705.3040）。17的1H和13C NMR数据显示存在一个二苯壬烷类基团（部分1），与I、II和III组化合物中观察到的类似。然而，17展现出一个二氢苯并呋喃新木脂素部分（部分2），而非两个苯丙基团。17中二氢苯并呋喃新木脂素部分的信号与20的信号相似（表1），在检测到一对间位偶联芳香质子的信号[δH 6.76（2H, s, H-2′′′,6′′′）]、一个ABX系统[δH 6.93（1H, s, H-2‴′）, 6.87（2H, s, H-5‴′,6‴′）]、两个次甲基质子[δH 5.07（1H, d, J = 9.4 Hz, H-13）和3.42（1H, m, H-14）]、一个甲基质子[δH 1.34（3H, d, J = 6.7 Hz, H-15）]、一个反式二取代烯烃[δH 6.27（1H, m, H-10）和6.13（1H, dt, J = 15.8, 6.4, H-11）]，以及两个甲氧基[δH 3.85（3H, s, H-16）和3.84（3H, s, H-17）]后，完成了结构确定。甲氧基的位置通过NOESY实验表征，揭示了H-17（δH 3.84）与H-2‴′（δH 6.93），以及H-16（δH 3.85）与H-2′′′（δH 6.76）之间的NOE相关性（图1）。此外，部分2通过C-12和C-2″与部分1相连，这由H-12（δH 3.39）与C-1″（δC 134.09）和C-3″（δC 116.96）之间的HBMC交叉峰所证实（图1）。对于17，在丙酮-d6中进行NMR分析，从而识别出更多的芳香质子（表S.15）。在二氢苯并呋喃环中，H-13和H-14之间较大的邻位偶合常数（J = 9.4 Hz）表明这些次甲基质子具有反式相对构型。26,27根据ECD谱中241 nm处的正Cotton效应，确定17的绝对构型为13S,14S，这与3′-甲氧基里卡林B（图S.46）不同。27,28因此，化合物17的结构得以阐明，如图表1所示。
根据正离子高分辨电喷雾质谱（HRESIMS）中m/z 557.2515处的离子峰[M + Na]+（计算值：C32H38O7Na，557.2515），确定了化合物21的分子式为C32H38O7。化合物21的核磁共振（NMR）数据（表2）显示，其第1部分的信号与化合物1的第1部分相似。对于第2部分，1H NMR谱包含一组1,3,4-三取代苯环的信号[δH 6.89 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2‴), 6.78 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5‴), 和 6.87 (1H, dd, J = 8.2, 2.0 Hz, H-6‴)]，两个甲氧基的信号[δH 3.85 (3H, s, H-13) 和 3.84 (3H, s, H-14)]，以及一个反式二取代烯烃的信号[δH 6.41 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-10) 和 6.20 (1H, dt, J = 15.8, 6.7 Hz, H-11)]。最后，我们发现第2部分通过H-12（δH 3.46）与C-2′（δC 160.44）、C-4′（δC 136.48）之间的核奥弗豪泽效应（NOE）相关性与第1部分相连（图1）。甲氧基的位置通过H-13（δH 3.85）与C-3‴（δC 149.19）以及H-14（δH 3.84）与C-4‴（δC 148.78）之间的异头碳-质子相关（HBMC）相关性得到确认（图1），并通过NOESY实验进一步证实，该实验揭示了H-13（δH 3.85）与H-2‴（δC 108.87）以及H-14（δH 3.84）与H-5‴（δC 111.38）之间的相关性（图1）。因此，确定了化合物21的结构，并展示在图1中。
Myfracone D（47）是从正离子HRESIMS中m/z 517.2929处的离子峰[M + Na]+（计算值：C31H42O5Na，517.2930）分离得到的一种黄色树胶状物质，其分子式为C31H42O5。它属于包含单萜-二芳基壬烷类偶联物的第VI组，47的单萜部分显示出三个亚甲基基团的特征共振信号[δH 0.44 (1H, t, J = 4.4 Hz, H-3‴a), 0.32 (1H, dd, J = 8.4, 5.0 Hz, H-3‴b), δC 9.74; δH 1.53/1.38 (2H, m, H-5‴), δC 28.18; δH 2.09/1.18 (2H, m, H-6‴), δC 33.61]，两个次甲基的信号[δH 1.50 (1H, m, H-2‴), δC 32.74; δH 1.52 (1H, m, H-10), δC 32.04]，以及三个甲基的信号[δH 0.82 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-11), δC 20.56; δH 0.82 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-12), δC 20.20; δH 1.42 (3H, s, H-13), δC 23.95]。通过检测到C-1‴/C-3′连接处的HBMC交叉峰（C-1′′′ (δC 45.37) 和 H-4′ (δH 7.32)），证实了第1部分与第2部分是相连的（图1）。基于观察到的H-4′（δH 7.32）与H-11（δH 0.82）、H-12（δH 0.82）以及H-3‴a（δH 0.44）与H-13（δH 1.42）之间的NOE相关性，确定了47的相对构型为rel-1‴S,2‴S,4‴R（图1）。随后，我们通过将47的实验电子圆二色谱（ECD）与简化后47的1‴S,2‴S,4‴R构型的计算谱进行比较，确定了47的绝对构型。此分析证实了其绝对构型为1‴S,2‴S,4‴R（图S.47）。因此，我们最终确定了47的结构，如图1所示。
图1. 分离得到的化合物1-22和41-52的结构
图1. 代表性化合物1、10、14、17、21和47的关键NOESY（黑色虚线）、COSY（红色粗线）和HMBC（蓝色箭头）相关性。
表1. 化合物1、10、14和17在CDCl₃中的¹H和¹³C核磁共振光谱数据（δ以ppm为单位，J以Hz为单位）
表2. 化合物21和47在CDCl₃中的¹H和¹³C核磁共振光谱数据（δ以ppm为单位，J以Hz为单位）
在初步生物活性方面，首先采用MTT法评估了分离得到的化合物对RAW 264.7细胞活力的影响（见图S.54）。结果表明，化合物1、3、5、6、8、10、15和21对细胞活力有显著影响，而化合物2、4、9、11、12、14以及1720对细胞活力无显著影响。因此，在后续实验中，选择了浓度为12.550 μM的化合物2、4、9、11、12、14以及1720，以评估这些化合物对NFkB/AP1、IRF活性以及促炎细胞因子和一氧化氮（NO）产生的影响。研究了化合物2、4、9、11、12、14以及1720对由TLR激动剂Pam3CSK4（TLR2）、Poly（IC）（TLR3）、LPS（TLR4）、FLA-ST（TLR5）和R848（TLR7-8）诱导的NF-κB/AP1和IRF信号通路的抑制作用，这对了解它们作为调节免疫反应的治疗药物的潜力提供了重要见解。我们发现，当暴露于TLR2、TLR4、TLR7和TLR8激动剂时，化合物2、4、9、11、12、14、17和18表现出显著的剂量依赖性NF-κB/AP1信号通路抑制作用（图2）。这一发现表明，这些化合物可能有效减轻该通路的激活，而该通路是促炎细胞因子和免疫反应的核心调节因子。在炎症过度为特征的疾病背景下，这种抑制作用可能具有重要价值。此外，我们的研究结果表明，当用TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR8激动剂处理时，化合物2、4、9、11、12、14、17和18也能有效抑制IRF信号通路（图3）。其抑制作用的剂量依赖性表明，这些化合物有可能对I型干扰素的产生和下游抗病毒反应进行精确控制。这一发现凸显了这些化合物在调节免疫反应方面的多功能性。此外，对这些通路最终产物（白细胞介素-6和NO）的评估显示，化合物2、4、6和11可以抑制这些促炎介质的产生（图4）。白细胞介素-6（IL-6）水平的降低表明，这些化合物可能有助于减弱在多种炎症疾病中发挥关键作用的促炎细胞因子风暴。抑制NO的产生也具有重要意义，因为NO的过度释放与炎症和组织损伤相关。
■ 结论
从M. fragrans种子中共分离得到33种新化合物。这些化合物包括8-O-4′-新木脂素-二芳基壬烷类共轭物（I、II组）、2,3-二甲基丁烷型木脂素-二芳基壬烷类共轭物（III组）、二氢苯并呋喃新木脂素-二芳基壬烷类共轭物（IV组）、丙烯基苯-二芳基壬烷类共轭物（V组）和单萜-二芳基壬烷类共轭物（VI组），以及另外两种新木脂素（化合物20和49）和20种已知化合物（化合物1、8和23~40）。化合物2、4、9、11、12、14、17和18对由TLR激动剂诱导的NF-κB/AP1和IRF信号通路表现出有前景的抑制作用（数据总结见表S.16）。值得注意的是，立体异构体表现出不同的活性，特别是在I组化合物中。具体而言，虽然10R,11R-异构体（1、3、5、6和8）表现出细胞毒性导致细胞死亡，但10S,11R-异构体（2和4）却产生了相反的效果（图S.54）。这些发现共同显著丰富了M. fragrans的化学多样性，并提示这些化合物可能成为治疗免疫失调和炎症性疾病的潜在药物。然而，还需进一步研究以阐明其确切的作用机制，并在体内模型中评估其安全性和有效性。尽管如此，本研究的结果为开发针对性的免疫调节干预措施提供了有价值的见解。
