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摘要
炎症细胞因子对免疫反应至关重要。当细胞暴露于细胞因子时，会进入一种“警觉状态”，这种状态提高了细胞对免疫系统的可见性。本研究中，我们鉴定了一种由P-茎存在定义的警觉状态核糖体亚群。我们发现，P-茎核糖体（PSRs）是在肿瘤免疫相关细胞因子的作用下形成的，且这一过程至少部分是通过P-茎的磷酸化介导的。PSRs通过更高效地翻译参与细胞因子介导过程的受体分子的跨膜结构域，参与优先翻译对细胞因子反应至关重要的mRNA。重要的是，PSR的缺失会抑制CD8+ T细胞的识别和杀伤能力，而抑制性细胞因子如转化生长因子β（TGF-β）会阻碍PSR的形成，这表明PSR是一个多个信号汇聚的中心调控枢纽。因此，PSR是通过翻译调控该过程，在细胞因子暴露后发生的细胞重编程中的关键介质。
引言
免疫逃避是癌细胞中众所周知的现象，并已被列为癌症的新特征之一。1 免疫检查点阻断（ICB）在多种癌症中的成功凸显了免疫监视在肿瘤控制中的重要性；然而，大多数患者要么不响应此类治疗，要么产生耐药性。2 众所周知，T细胞浸润肿瘤微环境（TME）是ICB的关键介导因素。3 T细胞不仅能直接杀死肿瘤细胞，还能分泌细胞因子，如干扰素-γ（IFNg）和肿瘤坏死因子α（TNF-α），因此，人类肿瘤常常表现出IFNg信号转导的转录特征。4 虽然IFNg信号转导是ICB反应的有用生物标志物，5 但它也会导致肿瘤细胞和免疫细胞行为的重大改变。6 当暴露于细胞因子时，细胞会进入一种警觉状态，其特征是趋化因子和检查点上调、抗原处理和呈递（APP）增加，7 以及在某些情况下出现衰老或凋亡。8 相反，抑制性细胞因子，如转化生长因子β（TGF-β）则会产生相反的效果，这在具有主导性免疫抑制性髓系细胞群的肿瘤中可见。9
然而，尽管存在这种重大改变及其显著的表型后果，但我们对细胞因子如何修改肿瘤行为的理解仍然不足。对细胞因子反应的分析往往侧重于转录调控，虽然存在一些细胞因子反应转录后调控的实例，10-12 但在这方面仍有很多需要了解的内容。
具有特定功能的核糖体群体的概念已经存在20多年，13,14 但仍然存在争议。最近的研究清楚地显示了核糖体比以前认为的具有更多的变异性，15,16 这支持了特定功能的可能性。17-20 翻译机制的许多成员都受到选择性调控，21 考虑到其复杂性，不难想象核糖体本身也可能如此。在此背景下，核糖体蛋白（RPs）的化学计量特别引人注目，16,22 已知RPs对T细胞的存活和发育、23-25 树突状细胞（DC）的激活26 以及B细胞的激活27 都至关重要，表明它们在免疫反应中发挥作用。实际上，“免疫核糖体”是一种假设的核糖体亚群，它选择性地产生抗原肽。28 最近的证据支持了RPs在这种背景下的作用，29 表明核糖体可能在细胞因子暴露的反应中发挥未被充分认识的作用。
基于此，我们推测存在一种由核糖体变化介导的细胞因子诱导的细胞重编程转录后机制。这种细胞因子反应的调控因子对于我们理解患者在ICB反应中的免疫调控至关重要。
在本研究中，我们鉴定了一种由P-茎存在定义的细胞因子响应性警觉状态核糖体群体，并证明这些P-茎核糖体（PSRs）通过该过程的翻译调控，是细胞因子暴露后发生的细胞重编程的关键介质。
图1. P-茎定义了细胞因子响应性核糖体亚群(A) 实验设置的示意图。(B) 在Mel624和M026肿瘤细胞中，暴露于干扰素-γ（IFNg）/肿瘤坏死因子-α（TNF-α）后，P1与翻译中核糖体（多聚核糖体）的结合增加。热图显示了细胞因子处理组与对照组中多聚核糖体与总核糖体的比例。n = 3次独立实验。(C) 蛋白质印迹分析证实，暴露于IFNg和TNF-α后，P1和P2与多聚核糖体的结合增加。使用HSP90作为上样对照，并使用uL30作为对照核糖体蛋白（RP）进行数据归一化。每种细胞系进行1次实验。(D) 转化生长因子-β（TGF-β）抑制P-茎核糖体（PSR）的形成。蛋白质印迹分析显示，暴露于TGF-β后，P1和P2与多聚核糖体的结合减少。使用HSP90作为上样对照，并使用uL30作为对照RP（未观察到变化）。每种细胞系进行1次实验。另见附图S1。
结果
P-茎定义了细胞因子响应的警觉状态核糖体
为了鉴定调控肿瘤细胞对细胞因子反应的核糖体蛋白（RPs），我们用干扰素-γ（IFNg）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理了人黑色素瘤细胞（Mel624和M026细胞系）。然后，我们对活跃翻译中的核糖体进行了蛋白质组学分析，以鉴定出响应处理而发生变化的RPs（图1A）。我们通过测量人白细胞抗原（HLA）I细胞表面表达增加（通过流式细胞术测定）和免疫蛋白酶体亚基表达（通过蛋白质组学测定；图S1A-S1D）来确认细胞是否处于细胞因子诱导的警觉状态。随后，我们使用蔗糖密度梯度离心法从这些细胞中分离出活跃翻译中的核糖体。我们还收集了总蛋白，并使用液相色谱-质谱（LC-MS）比较了细胞质中RP水平与翻译中核糖体中的RP水平。分析结果显示，在两个细胞系中，P1是翻译中核糖体中增加最多的蛋白质（图1B）。我们通过免疫印迹法测量多聚核糖体、亚多聚核糖体和总P1水平，确认了这一增加，结果证实IFNg/TNF-α暴露后，P1在多聚核糖体（活跃翻译中的核糖体）中显著增加。至关重要的是，另一种RP，uL30，并没有增加，这表明这不是对核糖体的普遍影响（图1C）。
P1与P2形成异二聚体，两个这样的异二聚体通过uL10锚定在核糖体上。这种五聚体茎（也称为P-茎）是核糖体GTP酶相关中心的核心组件。30有趣的是，P1/P2异二聚体长期以来被认为对翻译不是必需的，31并且与大多数其他RPs不同，它能动态地与核糖体结合。32为了了解我们检测到的细胞因子介导的变化是P1特异性的，还是P-茎增加的结果，我们测试了在细胞因子处理后，P2是否也在翻译中的核糖体中增加。尽管在我们的蛋白质组学分析中未鉴定出P2，但免疫印迹分析显示确实如此（图1C），这表明IFNg/TNF-α暴露后，P1/P2异二聚体添加到核糖体上的数量增加。
IFNg和TNF-α只是已知可调节警觉状态的两种细胞因子。其他实验显示，其他免疫激活细胞因子，包括IFNɑ/IFNb、白细胞介素-1b（IL-1b）、IL-6和IL17-A，也会增加P-茎核糖体（PSR）的丰度（图S1E和S1F），这表明无论炎症信号如何，PSR都会被激活。我们还用免疫抑制细胞因子（TGF-b）处理细胞，结果显示TGF-b会减少P-茎的结合（图1D）。我们在不同来源的细胞系（卵巢癌[SK-OV-3]、结直肠癌[HCT 116]和永生化视网膜色素上皮细胞[hTERT-RPE1]）中证实了这些发现（图S1G-S1I），表明核糖体对细胞因子的反应在不同组织中是一致的。这些结果表明，PSR可能是多个信号汇聚的调控节点，因此可能作为细胞因子介导过程的通用调控因子。
PSR调控抗原呈递程序（APP）
为了测量PSR对细胞因子介导的过程是否重要，我们使用短发夹RNA（shRNA）在两种黑色素瘤细胞系中敲低（KD）P1，使用了独立的shRNA（shP1#1、shP1#3）。我们还使用了一种针对对照RP（对细胞因子处理无反应）的shRNA（shL28）和两种对照乱序shRNA（shCtrl#1、shCtrl#2）。使用mCherry（%）表达测量转导效率，各细胞系的转导效率约为90%（数据S1）。不同发夹和不同细胞系的KD效率不同，Mel624细胞系对shP1#1和shP1#3的KD效率分别为42%和50%，而M026细胞系对shP1#1和shP1#3的KD效率分别为28%和16%（数据S1）。有趣的是，本手稿其余部分所述表型的强度与P1 KD的强度有一定的相关性，Mel624细胞系通常提供更可靠的结果，特别是与KD效率较差（16% KD）的M026 shP1#3细胞系相比。
为了研究PSR的功能相关性，我们评估了几个定义明确的过程。我们首先测量了通过P1 KD下调PSR是否会在没有细胞因子暴露的情况下减少细胞中的抗原呈递程序（APP）。确实如此，PSR的缺失导致泛I类（使用针对HLA-A、-B或-C的特异性抗体）和HLA-A2细胞表面表达均显著强烈下降，与感染shL28或乱序对照的细胞相比（图2A和S2A）。我们还测量了PSR缺失后HLA-B和HLA-C的表面水平，结果发现这两种标志物均显著强烈下降（图S2B）。然后，我们测量了这些细胞在酸介导去除后恢复表面HLA I的能力，并发现虽然恢复动力学相似，但P1 KD后恢复幅度显著降低，这与HLA I水平降低的细胞中的预期一致（图S2C）。接下来，我们用IFNg/TNF-α处理细胞，并测量它们通过上调HLA I细胞表面表达而进入警觉状态的能力。虽然所有细胞的细胞表面HLA I均有所增加，但与shL28或乱序对照相比，shP1细胞的增加显著减弱（图2B、S2D和S2E）。为了确保这是特定于含有P-茎的核糖体，我们还测量了在敲低uL30、eS10和eS28后细胞因子暴露下的HLA水平，这些敲低均未显示相同的减弱（图S2F和S2G）。此外，我们已证明TGF-b治疗通过减少P-茎的结合来抑制PSR的形成（图1D）。与此一致，TGF-b治疗也降低了HLA I细胞表面表达（图2C和S2H）。
然后，我们进行了黑色素瘤细胞/T细胞的共培养实验。33该实验基于供体CD8+ T细胞，这些细胞通过逆转录病毒转导了特异性针对HLA-A2限制性、来源于MART-1或NY-ESO-1的肽段的T细胞受体（TCR），而这两种肽段均由Mel624和M026肿瘤细胞呈递。如果抗原正确呈递，它们将被T细胞识别，从而导致T细胞激活（通过测量IFNg和TNF-α的产生以及CD107a细胞表面表达）和肿瘤细胞杀伤。虽然敲低eL28不影响T细胞识别，但敲低P1导致MART-1和NY-ESO-1特异性CD8+ T细胞对肿瘤细胞的识别显著强烈减少（图2D、S3A和S3B）。活细胞成像杀伤实验证实了这一发现，与shL28或乱序对照相比，表达shP1的细胞被T细胞杀伤的效率要低得多（图2E和S3C）。
尽管我们的数据表明这种效应不是核糖体普遍功能障碍的结果（图S2G），但我们还是测量了P1 KD是否会导致抗原来源蛋白的表达减少。然而，在shP1细胞中，MART-1和NY-ESO-1的水平基本未变（图S3D），这排除了这种可能性，尽管P1 KD确实降低了蛋白质合成（图S4A）和增殖（图S4B）。接下来，我们通过敲低另一种RP，eL6，将蛋白质合成抑制到相同程度（图S4C）。这种干预并没有导致HLA I细胞表面表达减少，这与PSR的作用不是基于其对全局蛋白质合成的影响这一结论一致（图S4D）。此外，由于已证明P-茎可调节GCN2的激活，34我们还测量了两种细胞系中磷酸化eIF2ɑ的水平。这些数据显示，无论是否进行IFNg/TNF-α处理，P1 KD后eIF2ɑ的磷酸化水平均无差异（图S4E），表明在细胞因子暴露后，P-茎的这一作用并不相关。
图2. PSR在不同细胞类型和组织中调节APP (A) P1敲低（KD）降低HLA I表面水平。使用平均荧光强度（MFI）通过流式细胞术评估HLA水平。n = 3次独立实验，每次实验均进行三重评估。数据表示为平均值±标准误（SEM），p值使用双尾t检验确定。(B) 与对照肿瘤细胞相比，暴露于干扰素γ（IFNg）/肿瘤坏死因子α（TNF-a）后，shP1细胞的HLA I基础表面水平较低。n = 3个生物重复样本，数据表示为平均值±SEM。p值使用双尾t检验计算。(C) 转化生长因子β（TGF-b）降低HLA I表面水平。使用MFI通过流式细胞术评估HLA水平。n = 4个生物重复样本。数据表示为平均值±SEM，p值使用双尾t检验确定。(D) 与对照细胞相比，shP1肿瘤细胞中MART-1和NY-ESO-1特异性CD8+ T细胞的识别能力降低。n = 3次独立实验，每次实验均进行三重评估。数据表示为平均值±SEM，与对照组（shCtrl）相关的p值使用双尾t检验确定。(E) shP1肿瘤细胞中MART-1和NY-ESO-1特异性CD8+ T细胞的杀伤作用受到抑制。n = 3次独立实验，每次实验均进行三重评估。数据表示平均值和误差±SEM，p值使用双尾t检验计算。(F) P1敲低降低人外周血单核细胞（PBMC）来源的巨噬细胞（无论是否激活（IFNg + 脂多糖（LPS）））的β2微球蛋白（b2m）表面水平。使用MFI通过流式细胞术评估b2m水平。n = 3个生物重复样本。数据表示为平均值±SEM，p值使用双尾t检验确定。(G) P1敲低降低B16小鼠黑色素瘤细胞的H-2Kb和H-2Db表面水平。使用MFI通过流式细胞术评估H-2Kb和H-2Db水平。n = 3次独立实验。数据表示为平均值±SEM，p值使用双尾t检验确定。(H) P1敲低降低小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）的b2m表面水平。使用MFI通过流式细胞术评估b2m水平。n = 3个生物重复样本。数据表示为平均值±SEM，p值使用双尾t检验确定。(I) P1敲低降低小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）的未成熟和成熟阶段的b2m表面水平。使用MFI通过流式细胞术评估b2m水平。n = 3个生物重复样本。数据表示为平均值±SEM，p值使用双尾t检验确定。另见图S2和S3。
PSR功能在不同细胞类型和物种间保守
为了探索我们研究结果的临床相关性，我们转向了TCGA数据库。35核糖体蛋白（RPs）往往受到共同调控，因此我们根据P1或P2相对于其他RPs的表达量对样本进行排序，从而控制全局性RP高/低表达，使我们能够专注于P1或P2水平高于其他RPs的样本。这一分析显示，高P1或P2水平（相对于其他RPs）与黑色素瘤中的干扰素γ（IFNg）特征36和效应CD8+ T细胞特征4显著正相关。至关重要的是，当以相同方式分析其他RPs时，我们并未观察到这种相关性（图S4F和S4G）。对TCGA数据的进一步分析显示，在大多数癌症类型（36种中的24种）中都存在这种显著相关性，表明P-stalk在不同组织中调节细胞因子反应（图S4H）。
为了进一步理解PSR的相关性，我们评估了原代人专业抗原呈递细胞（APCs）。我们从由白细胞层分离的人外周血单核细胞（PBMCs）中分离出CD14+单核细胞，并将其分化为巨噬细胞（BMDMs）或树突状细胞（DCs）。然后，我们敲低了P1（图S5A）；然而，虽然我们成功生成了修饰的巨噬细胞，但在DCs中敲低P1却未能实现，因此我们仅继续研究巨噬细胞。接着，我们在有和无激活（通过IFNg和脂多糖（LPS）处理）的情况下测量了抗原呈递。与我们之前已经表征的细胞系不同，我们不知道原代细胞的HLA单倍型，因此我们使用β2微球蛋白（b2M）抗体来量化抗原呈递能力（APP）。结果表明，PSR的缺失会显著降低原代巨噬细胞的APP，特别是在激活后（图2F）。
由于核糖体是一个高度保守的大分子复合物，我们还测试了这种APP调节机制是否存在于小鼠组织中。首先，我们在小鼠B16黑色素瘤细胞系中敲低了P1（图S5B），并测量了H-2Kb和H-2Db细胞表面表达，因为这些是已知由该细胞系表达的MHC I等位基因。P1敲低导致两种等位基因的细胞表面表达均减少（图2G和S5C）。我们还从小鼠中分离了骨髓来源的单核细胞以及BMDMs或DCs（BMDCs）。与人类细胞不同，我们在小鼠DCs和巨噬细胞中都成功敲低了P1（图S5D和S5E），并使用b2M抗体量化了APP。同样，P1敲低显著降低了这两种细胞的APP，证实了PSR也存在于小鼠细胞系和组织中（图2H和2I）。
总体而言，这些发现表明，PSR的缺失对细胞的抗原呈递能力有显著影响，并且在肿瘤细胞的情况下，会影响CD8+ T细胞检测和杀死它们的能力。此外，它在不同组织中保守，并存在于小鼠和人类中。
PSR优先翻译对免疫监视重要的mRNA
在确认PSR的重要性后，我们接下来着手理解其工作机制。在P1敲低后，我们首先使用一种泛I类特异性抗体测量了细胞内HLA I的蛋白水平。结果显示，总HLA I蛋白水平显著降低（图S5F）。然而，qPCR分析并未显示mRNA水平的变化（图S5G），提示存在转录后调控。使用蔗糖梯度密度离心法从这些细胞中分离核糖体组分显示，尽管HLA-A、-B或-C的mRNA水平没有变化，但在P1删除后，它们的多聚体结合显著减少，表明其受到翻译调控（图S5H）。
为了更全面地了解PSR的翻译组，我们在Mel624细胞系中表达了带有HA标签的P1版本，同时设置了一个表达带有HA标签的eL22的细胞系作为对照（图S5I）。与PSR作为APP调节剂的角色相符，P1过表达足以增加HLA水平，而eL22过表达则没有这种效果（图3A和S5I）。这些标签使我们能够在IFNg/TNF-a暴露后特异性地分离出含有P1和eL22的核糖体，并通过核糖体分析来表征相关的mRNA。免疫印迹证实了免疫沉淀后HA标签的富集（图S5J），而对所得核糖体分析的结果证实了这些数据中29-30个核苷酸的读取长度和3个核苷酸的周期性（数据S1）。这些数据显示，除了HLA I外，APP机制中许多其他组分的mRNA也优先与PSR结合，包括TAP1、TAP2和TAPBP（图3B）。此外，关键趋化因子（包括CXCL1和9）以及其他细胞因子调节的mRNA，包括T细胞募集的中央调节剂（ICAM1）37，也在PSR上富集，而TNF-a介导的凋亡的负调节剂（TNFAIP3）38则减少（图3B）。就背景而言，虽然APP组占检测到的翻译组的0.6%（2993个基因中的18个），但它占富集翻译组的7.5%（132个基因中的10个）。
与此相符，P1敲低导致细胞表面的IFNg受体减少，TNF-a受体也在一定程度上减少（图S6A和S6B）。有趣的是，这种减少似乎并不影响IFNg/TNF-a下游的信号传导，如通过STAT1磷酸化所测量的（图S6C）。总体而言，这些数据表明，整个细胞因子反应都受到PSR的调节。
基于这些发现，我们对激活和未激活的shP1细胞与shCtrl细胞进行了蛋白质组学分析。这些数据也显示，P1敲低后，多种APP组分的蛋白水平降低（图3C、S6D和S6E）。此外，基因集富集分析（GSEA）显示，与抗原呈递和HLA I相关的基因集在P1敲低后下调最为显著（图S6F），证实了这一过程中的多个成员与HLA I以相同的方式受到调控。
为了理解PSR调节特定mRNA的机制，我们更详细地分析了核糖体分析数据。对与PSR相关的mRNA上富集的序列特征进行注释发现，内质网（ER）中翻译的mRNA显著富集。虽然eL22富集的mRNA中有12.5%包含信号序列或跨膜结构域（TMD），但P1富集的mRNA中有76%包含它们（图3D）。对TMD包含mRNA上测序读数的分布进行可视化发现，在第一个TMD之后，含有P1的核糖体显著富集（图3E），这表明P-stalk在延长过程中可能导致特定mRNA的差异翻译。39,40先前已有报道，P-stalk对于登革热病毒复制是必需的，41因为它似乎对于解除核糖体在病毒RNA上的暂停是必需的。42同一项研究还表明，由于TMD等序列上可能发生的暂停，P-stalk有助于TMD的翻译，42这可能解释了所观察到的结果。
PSR激活和抑制表现出不同的动力学
为了更深入地理解PSR的激活和抑制，我们测量了细胞因子暴露后P-stalk结合的动力学。我们之前已经表明，P1和P2的总水平没有变化（图1C），并且我们证实了在暴露后它们并未在转录水平上上调（图S7A）。因此，我们用IFNg/TNF-a处理细胞1、6、12、24和48小时，并测量P-stalk的结合。结果显示，直到细胞因子暴露后48小时，结合量才增加（图4A和S7B），这与基于转录的激活相符，可能是通过表达伴侣蛋白或其他调节剂来实现的。然后，我们在TGF-b暴露后进行了相同的实验，惊讶地发现PSR失活（通过P-stalk去除）是一个极其快速的过程，在TGF-b暴露后仅1小时即可检测到P-stalk蛋白减少（图4B和S7C）。
PSR失活的速度表明其可能受转录后机制调控。有趣的是，P-茎蛋白已知会发生磷酸化，尽管这种修饰在P1和P2上的功能尚不清楚，但有研究表明第三个P-茎蛋白（uL10）的磷酸化可调节其与核糖体的结合。43,44由于这三个P-茎成员中的磷酸化位点都是保守的，43因此有理由认为P1和P2的修饰也可能调节它们与核糖体的结合。于是，我们对M026细胞系（分别在有和无IFNg/TNF-α的条件下）进行了磷酸化蛋白质组分析。这些数据显示，在处理后磷酸化水平降低，表明这是一种抑制性修饰（图4C）。
因此，我们编辑了内源性P2基因座，生成了不能在保守位点（S102/S105）发生磷酸化的细胞系。我们创建了两个不同的P2磷酸化失活克隆及其对照，但遗憾的是，由于序列不利，无法对P1进行同样的操作。由于我们假设这些磷酸化是抑制性的，所以我们用TGF-β处理细胞，并测量了P1和P2结合到核糖体中的情况。与抑制性作用相符，这些位点的磷酸化突变增加了基础P-茎结合水平（图4D）。此外，在一个克隆中，TGF-β暴露后观察到的结合减少被减弱，而在另一个克隆中则被完全消除，这表明TGF-β介导的磷酸化通过改变P-茎结合来调节PSR（图4D和S7D）。接着，我们在相同条件下测量了APP，结果显示P2磷酸化失活突变体在TGF-β存在的情况下保持了高水平的细胞表面HLA I，从而证实了PSR的磷酸化调控（图4E）。我们还尝试生成磷酸化模拟细胞系；然而，这些细胞无法存活。这并不意外，因为我们假设会持续磷酸化P-茎蛋白的慢性TGF-β处理对细胞是有毒的。有趣的是，P2磷酸化失活细胞系对这种慢性处理的抵抗力更强，进一步强调了P2磷酸化在TGF-β介导的表型中的作用（图S7E）。
图3. PSR优先翻译对免疫监视至关重要的mRNA (A) PSR过表达在未处理（P1-HA，HA-eL22）和IFNg/TNF-α处理（P1-HA++，HA-eL22++）的肿瘤细胞中增加HLA I表面水平。使用MFI通过流式细胞术评估HLA水平。n=3次独立实验。数据表示为平均值±标准误（SEM），并使用双尾t检验确定p值。(B) 核糖体分析揭示PSR优先翻译HLA和其他APP组分。PSR还优先翻译对免疫反应至关重要的关键趋化因子和其他细胞因子响应性mRNA。每种条件n=2个生物学重复，并使用DESEQ2软件包计算p值。(C) 蛋白质组学分析显示，在P1敲低（KD）和IFNg/TNF-α暴露后，HLA和其他APP组分下调。n=3次独立实验，并使用双尾t检验计算p值。(D) PSR优先翻译的mRNA富含编码信号肽和/或跨膜域的序列。(E) PSR在翻译首个跨膜域后的mRNA区域特异性富集。该图显示了参考集中所有基因首个跨膜域（TMD）末端每个密码子位置处，PSR与所有核糖体的聚合核糖体占据差异。另见图S4、S5和S6。
图4. PSR的激活和抑制表现出不同的动力学 (A) Western blot分析证实，IFNg/TNF-α处理48小时后PSR形成。在未处理的肿瘤细胞和在指定时间点（1、6、12、24和48小时）用IFNg/TNF-α处理的肿瘤细胞中测量P1的多聚核糖体结合情况。使用uL30作为对照核糖体蛋白（RP）进行数据归一化。每种细胞系进行1次实验。(B) Western blot分析证实，TGF-β处理1小时后PSR受到抑制。在未处理的肿瘤细胞和在指定时间点（1、6、12、24和48小时）用TGF-β处理的肿瘤细胞中测量P1的多聚核糖体结合情况。使用uL30作为对照RP进行数据归一化。每种细胞系进行1次实验。(C) IFNg/TNF-α暴露导致肿瘤细胞中P1/P2磷酸化丧失。n=3次独立实验。(D) P2磷酸化失活细胞系的Western blot分析显示，TGF-β通过磷酸化抑制PSR。在对照细胞和两种磷酸化失活细胞系（#23和#24）中，无论是否存在TGF-β，均测量了P1和P2的多聚核糖体结合情况。使用uL30作为对照RP进行数据归一化。其他比较见图S7D（IFNg/TNF-α vs. Ctrl，IFNg/TNF-α + TGF-β vs. Ctrl）的展示和量化。每种细胞系进行1次实验。(E) TGF-β介导的APP减少受磷酸化调控。使用MFI通过流式细胞术，在对照细胞和两种磷酸化失活细胞系（#23和#24）中，无论是否存在TGF-β，均评估了HLA水平。n=3次独立实验。数据表示为平均值±标准误（SEM），并使用双尾t检验确定p值。另见图S7。
讨论
众所周知，对于大多数癌症而言，趋化因子和HLA I的表达与检查点靶向治疗的临床反应密切相关。[45-47]确实，许多影响肿瘤“可见性”的改变已知是癌症免疫逃避的机制，并且在人类癌症中已观察到趋化因子和APP机制组分的沉默。[48-50]因此，发现这些基因的新型调控因子具有重要意义。
在此，我们展示了以下几点：首先，PSR受促炎和抗炎细胞因子的共同调控，使其成为多个信号汇聚的中心节点；其次，PSR选择性翻译许多细胞因子响应性mRNA，包括APP组分、趋化因子和其他有助于细胞因子暴露后细胞重编程的mRNA；第三，这一过程受磷酸化调控；第四，这是一种跨组织、癌症类型和物种的普遍机制。
核糖体本身处于这种调控的中心，这与近期关于核糖体直接调控表型的报告相符。[22,51-53]事实上，先前已有假设认为存在免疫核糖体，[28]其被定义为专门翻译用于HLA I免疫监视的缺陷性核糖体蛋白（DRiPs）的核糖体亚群，[13,14]从而改变抗原库。然而，PSR的作用远比这更广泛，它翻译参与多种细胞因子响应的mRNA，并作为警戒状态核糖体，不仅调控APP，还调控细胞因子暴露后发生的大部分细胞重编程。虽然由于核糖体在生物学中的关键作用，传统上并未将其视为可行的治疗靶点，但最近发现的动态核糖体蛋白（RP）/核糖体相互作用表明，实际上可能存在尚未实现的机会。[52,54]确实，P1/P2茎部蛋白是首批被证实能动态结合核糖体的RP，[55]从而在此背景下成为有趣的RP。
PSR为何以及如何优先翻译特定mRNA尚未完全确定。有趣的是，先前已有报道指出，核糖体P茎部对于翻译编码跨膜域（TMDs）的转录本是必需的，[42]我们在本研究中也观察到了类似效应。由于其功能，细胞因子响应性蛋白富含信号肽和TMDs，如HLA I和TAP转运蛋白，这至少可以部分解释本研究中描述的结果。然而，许多含有信号肽和TMDs的mRNA并未在PSR上富集，表明这只是部分情况。其他可能的解释包括特定RNA结合蛋白与mRNA结合介导的mRNA选择，[56]或核糖体定位的改变。一个将PSR与原始免疫核糖体概念联系起来的有趣假设是，P茎部将核糖体亚群定位到TAP相关的蛋白酶体上，以实现肽段通道化，[57]但本研究并未探讨此类额外机制。
我们的发现还引发了几个额外的问题。我们已证明，P茎部整合入核糖体受炎性（IFNg/TNF-α、IFNɑ/IFNb、IL-1b、IL-6和IL17-A）和抑制性（TGF-β）细胞因子的共同调控，但我们并未广泛测试所有相关细胞因子是否具有相同能力。了解PSR这一作用的普遍程度也将很有趣。我们对小鼠和人类原代细胞以及TCGA数据集的分析表明，大量组织中的细胞因子响应均以此方式调控。了解这一响应对于细胞因子暴露的特异性也至关重要。虽然P茎部对于翻译并非必需，[31]但已知其在招募翻译因子至延长的核糖体过程中发挥关键作用。[58-60]显然，在没有细胞因子暴露的情况下也存在含P茎部的核糖体（尽管其数量受细胞因子调控；图1），并且我们的数据表明，它们在基础条件下翻译不同的mRNA（图S6E）。这表明，尽管它们在细胞因子响应中明显发挥作用，但这可能是其更广泛功能的一部分。细胞因子响应性mRNA主要在内质网（ER）翻译，因此P茎部可能在SRP介导的核糖体暂停中发挥作用。[61]我们已证明，含P茎部的核糖体在TMDs后富集（图3E）。这种富集的模式（在TMD结束后约30个氨基酸处出现）表明，这发生在TMD从核糖体中出现并折叠时，这种情况已知会诱导核糖体停滞。[42,62,63]考虑到P茎部在翻译延长中的已确立作用，[58,59]不难想象它在克服此类停滞中发挥作用，这一功能不太可能仅限于细胞因子相关mRNA。在其他背景下，特别是在也涉及ER翻译增加的背景下（如分泌细胞系或衰老过程中），评估P茎部相关的翻译组将非常有趣。
无论这一响应的普遍程度如何，我们的数据都清楚地表明，PSR对于有效的细胞因子响应至关重要。在癌症背景下，P茎部蛋白的下调或PSR的抑制可能是肿瘤细胞逃避免疫监视或抵抗免疫治疗的机制。我们已证明，P茎部mRNA与IFNg和CD8+ T细胞特征相关；然而，这些数据来自批量RNA测序（RNA-seq），无法在此类数据中测试因果关系。确实，该特征可能是由其他贡献细胞类型中高水平的P茎部引起的，尽管大多数细胞已经以极高水平表达它们。此外，由于表达水平并不一定反映P茎部整合入核糖体的情况，因此这可能是评估PSR丰度的次优指标。尽管如此，我们认为本研究描述的结果表明，有必要进一步分析患者数据。
综上所述，我们已发现了一种新型的细胞因子响应主调控因子，其在基因表达的翻译调控层面发挥作用。虽然目前缺乏以高通量方式研究患者组织中特异性核糖体的技术，但这是未来研究中需要考虑的重要特征，并可能呈现治疗应用。
研究局限性
研究核糖体存在固有局限性。特别是，由于其高度结构化的特性，标记RP存在改变该结构并可能干扰其功能的风险。这需要在本研究呈现的核糖体分析背景下加以考虑，尽管使用了良好的对照和正交技术，使我们对结果充满信心。与此同时，敲低（KD）实验也面临类似的风险，即可能减少有功能核糖体的数量。区分由特异性核糖体驱动的表型和由功能性核糖体浓度变化驱动的表型可能很困难，我们通过使用多种正交方法来解决这一问题。
