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今天来读诺贝尔奖得主Gary Ruvkun对Tiny RNA的介绍文章：
过去十年来，微小RNA（RNA）领域一直风起云涌，
miRNA和其他小分子RNA从默默无闻到崭露头角，RNA干扰（RNAi）技术也横空出世。得益于深度测序技术的强大能力，我们获得了关于动物、真菌、植物甚至原生动物体内产生的小分子RNA的最全面描述。但在大多数情况下，这并不能立即揭示它们的功能，植物除外。在植物中，信使RNA（mRNA）与小分子RNA之间几乎完美的互补性，使得我们能够更精确地绘制出它们的功能图谱[1]。从植物中首次鉴定出miRNA以来，它们就已成为该领域的研究典范：它们的靶标对应于先前已鉴定出的一些调控花和叶形态建成的转录因子中的调控突变[1]。植物miRNA的研究结果令遗传学家惊叹不已，因为它们瞬间揭示了一条从miRNA到其易于识别的靶标mRNA的遗传途径。没有其他类型的基因鉴定能够如此准确地一步描绘出途径的轮廓。
就这样，植物miRNA领域实现了多年前对转录因子许下的虚假承诺——即发现一种将所有转录因子与其靶标基因联系起来的密码，从而揭示生物学的遗传级联反应。然而，每个转录因子实际识别的碱基对数量很少、转录因子结合位点序列的简并性以及转录因子的组合结合，使得这种解码绝非易事。另一方面，这也确保了转录研究社区的长期就业。
动物中，将miRNA映射到具有明确重要功能的靶标mRNA上的工作才刚刚开始。这证明了少量额外信息——植物miRNA::mRNA近乎完美的双链体与动物miRNA::mRNA凸环和环状互补体——在途径分配和功能提示证据之间的巨大差异。
植物领域的最新发现又回到了最初在动物中揭示小分子RNA的异时性突变上。最近已鉴定出植物miRNA可调节从幼叶到成叶以及枝条模式的转变（[2]，Scott Poethig，个人通讯）。甚至有证据表明，miRNA的变化可能在作物的驯化过程中发挥了重要作用。例如，玉米的Corngrass1突变是由一个转座子元件激活了一个miRNA，而这个miRNA经验证的靶标是已知的少数几个可调节从薏苡驯化成玉米的基因变异之一。这揭示了miRNA在驯化变异中的强大作用，并可能是古代不耐烦的植物育种者所选出的那种大突变[3,4]。人们也不禁对智人的驯化产生疑问。
小分子RNA的分类已经开始
尽管对小分子RNA的基因组探索令人印象深刻，但我们仍只是看到了冰山一角。使用体外RNA选择和连接技术的强大克隆方法，以及深度测序方法惊人的生产能力，揭示了小分子RNA世界这一方面的相当完整的调查。但它们就像一种在特定波长下观测的望远镜：在这种情况下，主要研究的是那些例如具有50个单核磷酸盐的小分子RNA，它们是DICER的可能产物。然而，过去几年的一个主要发现——与PIWI蛋白的PIWI亚型相关的piRNA——是通过一种不依赖于DICER的过程产生的[5]。因此，一个可能由其他核酸酶产生的小分子RNA宇宙突然被提出。并非所有这些其他途径都可能产生50个磷酸盐。因此，无论RNA连接策略多么巧妙和有用，它可能只能揭示小分子RNA的一个子集。当前的深度测序方法现在允许采用较少选择性的方法来发现其他类别的小分子RNA。
但小分子RNA的其他修饰可能会困扰这些生化调查：30位羟基的甲基化是一种会干扰连接反应的修饰类型。从50年对核糖体和tRNA的研究中，人们已经知道了RNA的其他修饰，包括硫醇化、糖基化、乙酰化和其他更罕见的修饰。如果这些修饰中的任何一种阻止了RNA连接酶或逆转录酶识别这些修饰的RNA，那么它们将在这些生化研究中被系统地遗漏。另一方面，考虑到小分子RNA的信息功能，这种修饰的RNA与DNA或RNA碱基配对的能力可能是完整的，因此依赖于碱基配对进行分析的生化纯化可能会检测到这些异常值。并且，小分子RNA的基因组序列特征、它们在相关物种中的保守性以及它们的二级结构，将继续帮助鉴定候选分子。在这方面，植物基因组与小分子RNA具有更完美的互补性，可能通过其与mRNA中保守序列的互补性，在鉴定小分子RNA方面具有强大的信息学能力。
小分子RNA蛋白辅因子的分类处于更早的阶段
在从RNAi和miRNA遗传现象学推断出miRNA和siRNA的加工介导蛋白辅因子存在后，对其进行的生化分析进展迅速。然而，对动物miRNA翻译控制方面的生化研究并未取得同样显著的进展，这很可能是因为它与核糖体相交，而核糖体具有一组复杂的相关蛋白，因此难以与其他翻译控制因素分离。但是，已经完成了对miRNA[6]和其他小分子RNA途径[7]的饱和遗传分析，并且这些研究揭示的一些甚至可能是许多因素将被证明在该过程中介导其他步骤。与任何复杂过程一样，DICER和ARGONAUTE下游可能有许多步骤来解释这些小分子RNA，并且可能由miRNA和siRNA辅因子的同源物介导的其他小分子RNA的旁系途径，就像ARGONAUTE同源物介导piRNA功能一样。该领域的大部分研究都有点近视地关注DICER或PIWI蛋白，因为它们是某些小分子RNA产生和首次活动的中心。但越来越多的证据表明，存在RNA调控的细胞生物学，特别是在P小体和P颗粒中，因此可能存在更复杂的协同作用。在这方面，细胞骨架元素已成为miRNA途径中强有力的候选活动元素，这可能具有重要意义[6]。有趣的是，已有研究表明RNA与细胞骨架相关[8]。
尽管该领域倾向于将生化研究焦点放在DICER和PIWI蛋白上，但这确实是一个富有成效的研究方向：例如，piRNA最直接地来源于对PIWI蛋白PIWI亚型的简单免疫沉淀[7]。同样，miRNA与动物中的一种Argonaute亚类相互作用。可以很好地对所有可能的小分子RNA途径蛋白进行类似分析，以研究小分子RNA的结合。通过这种方式，可以将特定大小和序列类别的小分子RNA映射到特定的蛋白辅因子上。这将通过其相互作用来证实小分子RNA和候选蛋白辅因子的存在。
Argonaute蛋白远亲的结构生物学探索
鉴于尚未有真核蛋白结构被解析，对Argonaute蛋白结构的解读一直过于热切。人们原本期望晶体学家会选择功能注释良好的PIWI结构域蛋白进行结构研究，例如秀丽隐杆线虫的RNAi因子RDE-1，或是ARGONAUTE亚型的miRNA或siRNA辅因子，或是PIWI亚型的生殖系piRNA辅因子。然而，由于从这些蛋白中获得良好晶体的技术难度，以及RNA研究领域的激烈竞争，三个研究小组选择了真核PIWI蛋白的奇异远亲来进行结构测定：一种来自古菌Pyrococcus furiosus[9]，另一种来自古菌Archaeoglobus fulgidus[10]，还有一种来自深度分歧的细菌Aquifex aeolicus[11]，后者被认为其约10%的基因来自古菌。这些被选为晶体学研究的蛋白不仅是真核PIWI PAZ蛋白的远亲，彼此之间也相距甚远：当我在Blast分析中，以PIWI亚型或ARGONAUTE亚型的真核PIWI蛋白为查询序列，对所有古菌或细菌基因组序列进行搜索时，这些已解析结构的蛋白的得分仅略高于背景水平，并且e值至少比动物、植物、真菌或原生动物中的PIWI/PAZ直系同源物或旁系同源物低50个对数单位。而且，当将所谓的Pyrococcus、Archaeoglobus或Aquifex的PIWI蛋白与整个蛋白质数据库进行Blast比较时，它们之间仅存在较远的亲缘关系，并且在整个数据库中仅检测到少数几个非常遥远的细菌或古菌蛋白。这些已解析的蛋白以e-5或更低的e值检测到真核PIWI蛋白；这种程度的同源性在大多数同源性专家看来并不具有显著性。古菌和细菌中缺乏PIWI蛋白的情况也得到了它们同样缺乏DICER的支持。
因此，令人惊讶的是，这些来自Pyrococcus、Archaeoglobus和Aquifex的PIWI蛋白远亲的结构测定已成功用于预测ARGONAUTE和PIWI蛋白的结构特征。事实上，来自古菌结构的关键催化残基被用来成功预测真核PIWI蛋白的相同残基，表明即使氨基酸序列同源性较低，这些结构也可能具有预测性。然而，发现古菌PIWI蛋白结合DNA的能力优于RNA，这表明这些远亲可能具有与DNA修饰而非RNA切割或翻译控制相关的功能[11]。
这些基因介导DNA功能的观点得到了古菌基因操纵子结构的支持。古菌和细菌拥有操纵子中基因注释的绝妙工具，因此如果同一操纵子中的其他基因具有更有说服力的注释，就可以推断出遗传途径的功能。在Pyrococcus furiosus中与PIWI远缘相关的基因的情况下，它并不位于操纵子中。但当我以这个基因为查询序列进行搜索时，得分最高的是古菌Methanococcus jannaschii中的开放阅读框MJ1321，其e值为e-58，比真核PIWI蛋白的同源性高出50个对数单位。这显然是一个直系同源物，但到目前为止，它是数据库中唯一可以检测到的。MJ1321与另外四个基因位于同一个操纵子中，这些基因被注释为：50 MJ1323（DNA修复蛋白RAD32的同源物）、MJ1322（DNA修复核酸外切酶SbcC的同源物）、MJ1321（真核PIWI蛋白的远亲）和MJ1320（无同源性）。
同样，Aquifex的远缘PIWI蛋白位于一个具有DNA修复注释的操纵子中：50 aq 1449（具有8-oxo-dGTPase结构域或MutT结构域）、aq 1447（远缘PIWI相关蛋白）、aq 1446（无蛋白质同源性）、aq1445（铜转运ATP酶）和aq1444（无同源性）。在Archaeoglobus fulgidus的PIWI相关蛋白AF1318的情况下，它与AF1317位于同一个操纵子中，但这个基因没有同源性。
对这些操纵子结构的一种解释是，这些非常遥远的PIWI蛋白在祖先层面上介导了与真核PIWI蛋白的RNA切割和修饰功能相关的DNA修饰功能。然而，古菌和细菌基因组数据库中这些PIWI亲缘蛋白的数量非常稀少，这表明已解析的古菌和细菌PIWI蛋白所介导的功能并不是古菌或细菌生命的一般特征。它们可能代表了极少数从真核生物获得水平基因转移的谱系。或者，它们可能代表了古菌和细菌分支中尚未删除的、在真核生物中仍然需要的DNA修饰基因功能的最后遗迹。
向细胞核进发
这些远缘PIWI蛋白所建议的DNA修饰功能对真核生物中ARGONAUTE蛋白的功能具有启示意义。DNA修饰功能也可能在真核PIWI蛋白中得到维持。它们已在细胞核和细胞质中均有发现[12]，这表明这些蛋白的功能可能不仅仅是捕获从DNA双链中产生的RNA转录本；它们还可能将它们甩回DNA上，以介导如DNA甲基化等修饰，这在沉默的植物基因中已有报道[13]。
当然，能够看到真核PIWI蛋白的实际结构将是非常棒的。虽然难以解释为什么真核PIWI蛋白对晶体学如此抗拒，但可以推测，在用于结晶的混合物中可能系统地缺少了一个组分。这可能是一个缺失的蛋白质辅因子，但也可能是一个缺失的RNA辅因子，其缺失允许PIWI蛋白存在多种可能的构象，从而阻碍或扰乱结晶过程。
在古菌和细菌中，PIWI操纵子分析揭示的Argonaute蛋白具有DNA修复功能的线索，得到了原生生物中PIWI蛋白和相关RNAi因子在DNA消除中的功能的强烈支持[11]。类似地，ARGONAUTE和DICER蛋白已被证实在真菌、植物和动物中参与染色质沉默[14]。但令人惊讶的是，在S. pombe的研究表明小RNA调节异染色质化以来已超过5年的时间里，关于小RNA与染色质因子相互作用的记录却如此之少。我本以为会有数十种染色质因子，特别是已知的表观遗传重塑因子如多梳基因家族成员，会被证实能直接结合小RNA。一种解释可能是，小RNA与染色质因子之间并没有发生简单的相互作用。S. pombe的研究确实表明，直接与PIWI蛋白相互作用的复杂蛋白质机器介导了小RNA引起的异染色质变化[15]。
为什么线虫和植物推动了小RNA革命？
当然，我们愿意相信这是因为我们的智力优势。对科学的良好品味或许是一个更站得住脚的观点。但也许真相在于这些不同分类群之间的生物学统一性。线虫在动物界中的标志性特征是，从一个全能受精卵到完全形成的成虫只需要大约十几次细胞分裂。因此，首先在线虫中揭示小RNA世界的异时性突变，在细胞从全能性重编程为成虫的最初几步中介导了多能性与确定细胞命运之间的决定。细胞谱系分析是早期C. elegans遗传分析的一大进步，它是观察这些细胞命运决定的透镜，而线虫不到1000个细胞的数量使得这些细胞命运的重大转变足以存活下来以供分析。同样，植物的主要器官来源于全能性的茎尖分生组织，并且距离这种全能性只有几次细胞分裂之遥，因此，小RNA途径中细胞承诺缺陷的突变植物可以被解释。ARGONAUTE和DICER途径首先出现在植物花卉和叶片图案遗传学中[16,17]，这并非巧合。
在植物和线虫中发现RNAi并不奇怪：由于RNA依赖的RNA聚合酶对小干扰RNA（siRNA）的扩增以及这些小RNA的系统性传播，植物和线虫中的dsRNA基因沉默更为强烈。但为什么这些分支比其他分支更强烈地使用RNAi呢？一种观点是，病毒的侵袭对于这些土壤栖息物种来说是一个更大的问题。然而，尽管RNAi途径确实与病毒抗性有关，但病毒似乎并不是植物或线虫比其他生物更严重的问题。另一种观点是，小RNA在植物和线虫中以系统性传播的形式作为一种激素信号，要么是关于病毒状态，要么是关于在植物和线虫中更为流行的其他信息冲击。植物和线虫中siRNA的系统性传播确实表明，其他小RNA构成了信号分子。事实上，植物中的Teopod突变与玉米miRNA突变非常相似，已被证明是非自主性的[4]，尽管植物和动物中的大多数miRNA似乎都在其表达的细胞中发挥作用[18]。尽管在植物和线虫中，可能不是miRNA构成了细胞间信号传导的超级高速公路，但随着遗传、信息和生化分析的日益复杂，其他尚未鉴定的微小RNA信号包可能会逐渐显现。
致谢
感谢Scott Poethig和Venkatesan Sundaresan与我讨论这些想法，并指引我走向了许多我自己无法找到的方向。
