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摘要：
银杏（Ginkgo biloba L，简称GB）种子在全球范围内被广泛使用。本研究探讨了保留银杏全部营养成分的全银杏种子粉（Whole GB Seed Powder，简称WGP）在抗衰老、抗动脉粥样硬化和抗疲劳方面的生物效用。实验结果表明，WGP能够降低老年小鼠脑内的单胺氧化酶和血清中的丙二醛水平，提高胸腺/脾脏指数，改善学习能力，并延缓衰老。WGP通过降低甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平，提高高密度脂蛋白胆固醇水平，并降低动脉粥样硬化指数，从而调节血脂水平并预防动脉粥样硬化。WGP还能减少血乳酸积累，延长力竭游泳和攀爬时间，提高运动表现；通过提高肌肉/肝脏糖原水平来增加能量储备，并缓解身体疲劳。网络药理学分析揭示了WGP在炎症抑制、代谢调节和抗细胞衰老等细胞通路中发挥作用的270个潜在靶点。蛋白质-蛋白质相互作用分析确定了10个核心基因，包括FOS、ESR1、MAPK8和SP1等靶点。分子对接和分子动力学模拟表明，WGP中的生物活性化合物与目标靶点结合良好。本研究表明，WGP通过多种成分、靶点和通路发挥显著的健康促进作用。
引言
衰老是一个以器官及其功能退行性损伤为特征的过程[1,2]。衰老是许多与年龄相关疾病（如动脉粥样硬化、神经退行性疾病和痴呆）的最大单一风险因素，也是慢性疲劳综合症、高血压和骨质疏松等许多与年龄相关疾病的重要风险因素[3,4]。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特征是动脉壁形成包含炎症细胞和脂质的斑块[5]。高龄是动脉粥样硬化的一个独立风险因素[6,7]。动脉粥样硬化也是心血管疾病（CVDs）如心肌梗死、脑梗死和中风的主要原因[8]。与年龄相关的心血管疾病风险因素和认知障碍相互影响。疲劳是衰老或与年龄相关疾病的一种症状或共病[9]。疲劳会降低生活质量并影响疾病的预后[10,11]。考虑到安全性和有效性，天然产物在预防衰老、动脉粥样硬化和疲劳方面的潜在功效已引起广泛关注。
银杏（Ginkgo biloba L，简称GB）已存在2亿年，被视为“活化石”[12]。GB含有多种生物活性成分，包括黄酮类、烷基酚类和多糖类，具有多种药理作用[13,14]。GB叶提取物已广泛用于治疗不同疾病，如阿尔茨海默病、心血管疾病和脑供血不足[15-17]。叶提取物作为抗衰老疗法来减缓衰老和与衰老相关的疾病也越来越受到关注[18,19]。与大量关于叶提取物的研究相比，关于银杏种子或种皮（含有与叶片中相同的生物活性成分，如黄酮类、萜类三内酯和烷基酚类，可能具有相似的治疗效果）的研究却很少[20,21]。然而，GB原生种子中的有毒成分，如银杏毒素和银杏酸，阻碍了其应用[22]。
网络药理学提供了一种有用的方法，通过克服“一种疾病-一个靶点-一种药物”的问题，系统地揭示含有多种成分的天然产品的潜在机制[23]。这种方法通过发现多个潜在靶点和通路，探索活性多成分与疾病之间的整体关系[24]。分子对接和动力学模拟可以预测受体-配体复合物的结合模式、亲和力和结构稳定性[25]。
本研究调查了使用国家授权专利技术制备且未添加任何化学添加剂的全银杏种子粉（Whole GB Seed Powder，简称WGP）在延缓衰老、预防动脉粥样硬化和缓解生理疲劳方面的作用。我们测量了经WGP处理的衰老或疲劳小鼠的生化参数，并确定了经WGP处理的高脂饲养大鼠的血脂水平和动脉粥样硬化指数（AI）。此外，我们应用网络药理学分析了WGP中活性成分的目标基因。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析确定了WGP的前10个目标基因，而基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）细胞通路系统提供了WGP与疾病的生物通路。分子对接技术进一步在分子水平上揭示了WGP重要活性成分与主要核心靶点的结合模式。本研究旨在评估WGP的多功能性并理解其潜在机制（图1）。
图1. 示意图，描绘了实验研究和网络药理学分析，以评估全银杏（Ginkgo biloba L）粉的多功能疗效。
2 材料与方法
2.1 材料
D-半乳糖（D-gal）（纯度≥98%）由鼎国昌盛生物技术有限公司（中国北京）提供。维生素E（VE）软胶囊（批号10874004）购自国药星沙制药有限公司（中国厦门）。维生素D3（300,000 U/mL）购自哈尔滨卓宏达动物药厂（中国哈尔滨）。辛伐他汀（Sim）片（1 mg/片）由哈尔滨药业集团三精明水药业有限公司（中国绥化）提供。高脂肪饮食（HFD，含3%胆固醇、0.2%猪胆盐、15%砂糖、20%猪油和61.8%高蛋白颗粒饲料）购自生民实验动物养殖场（中国南京）。血尿素氮（BUN）、血乳酸（BLA）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、单胺氧化酶（MAO）、肌糖原（MG）和肝糖原（LG）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（中国南京）。总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒购自迈瑞医疗国际有限公司（中国深圳）。本研究中使用的其他试剂均为分析纯。
2.2 WGP的制备
原料银杏（GB）采自中国东台市江港镇八里村（32.525229°N 120.462100°E）。全株植物经南京林业大学南方林业可持续发展协同创新中心曹福亮教授鉴定为银杏（Ginkgo biloba L）。WGP由江苏东台捷尔银杏科技有限公司（中国东台）提供。WGP采用国家授权专利技术（CN104432272A，中国）制备。简而言之，将新鲜银杏种子去硬外壳和内果皮，然后捣碎并用100目筛过滤。将所得浆液在150°C下凝胶化60秒，然后在150°C和0.5 mPa蒸汽压下脱水干燥。将干燥的银杏种子聚集体粉碎，并用5目筛过筛，得到WGP。
2.3 动物
幼年（28日龄）和成年（300日龄）昆明小鼠购自重庆医科大学实验动物中心（中国重庆）。动物饲养在20 ± 2°C、相对湿度55 ± 5%、12小时光照/12小时黑暗循环的条件下。所有体内外研究均按照重庆医科大学制定的《动物实验指南》进行。本研究方案经重庆医科大学动物实验伦理委员会批准（SCXK（渝）2018-0003）。所有作者均已阅读并批准本手稿。
2.4 抗衰老活性测定
2.4.1 D-半乳糖诱导衰老小鼠及处理
幼年（n = 10，雌雄各半，A组）和成年（n = 60，雌雄各半）昆明小鼠在整个实验期间可自由获取饲料和水。
适应环境7天后，A组（阴性对照，年轻正常）和B组（阴性对照，成年正常，n = 10）在实验期间给予标准饲料和水。C-G组（每组n = 10）小鼠皮下注射D-半乳糖（1 g/kg小鼠/天）以诱导衰老。C组小鼠作为阴性对照（老年，模型组）。D-G组小鼠分别口服治疗药物（VE，0.1 g/kg小鼠/天）和WGP（2、4和6 g/kg小鼠/天，分别对应WGP-L、-M和-H）。小鼠饲养28天后进行Morris水迷宫测试。
2.4.2 Morris水迷宫测试
水迷宫（直径120 cm，高50 cm，ZS-001，北京科迪中创有限公司，中国北京）内充满水（20 ± 1°C），分为四个象限。在第一象限放置一个直径6.5 cm、高15 cm的移动平台，平台淹没于水面下1 cm处[26]。前五天，每天训练每只小鼠从每个象限的入口点找到隐藏的平台。如果小鼠在90秒内找到平台，则允许其在平台上停留15秒，并记录逃避潜伏期为15秒。如果小鼠在90秒内未找到平台，则引导其到平台并停留30秒，并记录逃避潜伏期为90秒。第七天移除隐藏平台进行空间探索试验。将小鼠从第三象限的同一起点放入，让其自由游泳120秒。记录并分析每只小鼠的游泳轨迹、穿越平台次数、游泳距离和在第一象限的时间。
2.4.3 血清和组织中的生化参数
行为学调查后，收集血液样本以及脾脏、胸腺、心脏、肝脏、肺、肾脏和脑组织。血液样本在4°C下以1000×g离心10分钟以分离血清。所有样本均储存在-80°C以备进一步分析。清洁后的脑组织在冰浴中用冷盐水匀浆。然后，将组织匀浆在4°C下以1000×g离心10分钟。收集上清液进行生化分析。使用相应的检测试剂盒测定血清SOD、MDA和脑组织MAO活性。使用公式（1）和（2）计算脾脏和胸腺指数。
脾脏指数（%）= 脾脏重量/体重 × 100% （1）
胸腺指数（%）= 胸腺重量/体重 × 100% （2）
其中，Wspleen、Wthymus和Wbody分别指脾脏、胸腺和体重。
2.4.4 组织病理学分析
小鼠的肝脏、肺脏和肾脏用4%多聚甲醛固定24小时，然后包埋于石蜡中。使用切片机（Leica，德国Wetzlar）切成4 µm厚的切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。通过光学显微镜（Nikon，日本东京）观察肝脏和肺脏组织的组织病理学变化。
2.5 抗动脉粥样硬化活性测定
2.5.1 饮食与处理
健康Sprague Dawley雄性大鼠，体重200 ± 20 g（6~8月龄），购自重庆医科大学重庆实验动物中心（中国重庆）。大鼠饲养在标准条件下。正常饮食喂养7天后，B-F组（每组n = 10）大鼠通过口服给予高脂肪饮食（自由获取饲料）和腹腔注射给予维生素D3（维生素D3又称胆钙化醇；前3天腹腔注射600,000 IU/kg大鼠），持续70天，以建立早期动脉粥样硬化模型。A组（阴性对照）大鼠给予正常饮食。B组（阳性对照）大鼠不接受任何治疗。C组大鼠口服辛伐他汀，剂量为1 g/kg大鼠。D-F组大鼠分别给予0.5、1.0和1.5 g/kg大鼠/天的WGP。所有大鼠在70天内每3天称重一次。
2.5.2 血清化学分析
第70天收集血液样本，并以1000×g离心10分钟。上层血清储存在-80°C以备进一步分析。使用自动生化分析仪BW-200（Bioway，中国烟台）测定TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。使用以下公式（3）计算动脉硬化指数（AI）值。
AI（%）= （LTC - LHDL-C）/LHDL-C × 100% （3）
其中，LTC和LHDL-C分别指TC和HDL-C水平。
2.5.3 组织病理学检查
新鲜主动脉和心脏清洁后用4%多聚甲醛固定。24小时后，样本包埋于石蜡中，使用切片机（Leica，德国）切成5 µm厚的切片，进行H&E染色。通过光学显微镜（Nikon，日本）观察病理变化。
2.6 抗疲劳活性测定
2.6.1 动物与实验设计
40只健康雄性昆明小鼠（28日龄，20 ± 2 g）购自重庆医科大学重庆实验动物中心（中国重庆）。动物饲养在标准动物室温度（20 ± 2°C）、湿度50 ± 10%和12小时昼夜循环的条件下。小鼠可自由获取实验饲料和水。小鼠在实验前适应7天，然后随机分为四组（n = 10）。A组（阴性对照）小鼠给予正常饮食。B-D组小鼠分别给予2、4和6 g/kg小鼠/天的WGP，持续28天。所有小鼠饲养28天后用于以下抗疲劳实验。
2.6.2 爬杆测试
爬杆测试基于之前的实验进行[27]。最后一次口服给药后30分钟，将小鼠放在一根玻璃棒（高40 cm，直径8 mm）上，使其肌肉处于紧张状态。当小鼠因肌肉疲劳而从玻璃棒上掉下时，停止爬杆测试。总爬杆时间计算为三次记录的总和。
2.6.3 力竭游泳测试
力竭游泳测试在爬杆测试后的第二天进行，如之前所述[28]。简而言之，最后一次处理后60分钟，给小鼠尾部系上相当于其体重5%的负重，然后放入水深40 cm（30 ± 1°C）的游泳池中。记录从小鼠放入池中到其力竭（即小鼠无法浮到水面超过10秒的时间点）的整个时间。
2.6.4. 血液生化参数和组织糖原的测量
小鼠在第二天进行90分钟自由游泳后进行力竭游泳测试，随后被处死。通过1000×g离心10分钟收集血液以制备血清。立即从小鼠体内取出肝脏和肌肉（后腿股四头肌）。血清和器官在-80°C下冷冻保存以备后续测试。使用商用试剂盒测定血尿素氮（BUN）和血乳酸（BLA）水平。将一定重量的清洁器官与9倍体积的生理盐水混合并研磨以获得组织匀浆。使用商用试剂盒测量肌肉糖原（MG）和肝糖原（LG）。
2.7. 网络药理学分析
2.7.1. 活性化合物筛选和潜在靶点识别
所有WGP的生物活性成分均从TCMSP数据库（https://www.tcmsp-e.com/#/home，访问日期：2024年6月11日）[29,30]中收集。为确保其在体内的代谢潜力，根据口服生物利用度（OB）和类药性（DL）等参数对所得成分进行筛选。筛选标准为OB值≥30%，DL值≥0.18。然后，从TCMSP中获得活性成分的潜在靶点，并使用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/，访问日期：2024年6月11日）将其转换为相应的基因符号。
2.7.2. 靶基因的识别
疾病靶点从GeneCards数据库（https://www.genecards.org/，访问日期：2024年6月11日）、人类孟德尔遗传在线数据库（OMIM，https://omim.org/，访问日期：2024年6月11日）、治疗靶点数据库（TTD，https://db.idrblab.net/ttd/，访问日期：2024年6月11日）和DisGeNET数据库（http://www.disgenet.org/，访问日期：2024年6月11日）[31]中收集。随后，对所有搜索结果进行编译、汇总和去重，为衰老、动脉粥样硬化（AS）和疲劳创建靶标库。
2.7.3. 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析
使用Venn图分析潜在活性化合物与疾病之间的重叠靶基因。然后，使用Cytoscape 3.9.1软件构建WGP化合物-靶标-疾病网络图。利用STRING数据库（https://string-db.org，访问日期：2024年6月11日）获取成分靶标与疾病靶标之间重叠靶标的蛋白质相互作用关系。将生物体设置为“Homo sapiens”，并将置信水平设置为>0.9。使用Cytoscape 3.9.1软件建立蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并使用CytoHubba插件筛选出前10个核心靶标[32]。
2.7.4. GO和KEGG通路分析
将与WGP活性化合物和疾病均相关的重叠基因导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov，访问日期：2024年6月11日），并选择“Homo sapiens”物种进行GO和KEGG富集分析[33]。根据错误发现率（FDR）<0.05的标准筛选结果，按p值从小到大排序，并选择前10个结果。然后，绘制高级气泡图以直观展示GO和细胞通路富集结果。GO分析结果分别按生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（M）类别进行排序和可视化。
2.7.5. 分子对接分析
根据WGP化合物-靶标-疾病网络，筛选出前3个关键活性成分，并从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov，访问日期：2024年6月15日）下载这些化合物的3D结构文件。从RCSB-PDB数据库（FOS-PDB ID: 1FOS, ESR1-PDB ID: 1A52, MAPK8-PDB ID: 3ELJ, SP1-PDB ID: 1VA1，https://www.rcsb.org，访问日期：2024年6月15日）下载三维蛋白质晶体结构。使用Discovery Studio软件（2019年版）进行分子对接，以验证化合物与靶标的相互作用。
2.8. 统计分析
使用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有数据均表示为均值±标准差（SDs）。不同组间的多重比较采用单因素方差分析，随后进行Duncan检验。当p<0.05时，认为数据存在显著差异。
3 结果
3.1. 抗衰老活性
3.1.1. 学习与记忆能力评估
D-半乳糖诱导的衰老小鼠表现出复杂且无目标的运动轨迹，并且难以找到平台（图2A-G）。与模型组小鼠相比，WGP提高了衰老小鼠找到平台的能力，并增加了它们在平台所在象限的移动时间和距离（图2H-J）。苇谷精改善了衰老小鼠的学习与记忆能力。高剂量的WGP-H似乎具有最佳效果。
图2. 全银杏粉（WGP）对D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老小鼠在水迷宫测试中的（A-G）运动轨迹图、（H）穿越虚拟平台次数、（I）第一象限停留时间以及（J）第一象限移动距离的影响。数据表示为平均值±标准差（SDs）（n=10）。*和#分别表示与成年对照组（B组）和老年对照组（C组）相比，p<0.05；##表示与老年对照组（C组）相比，p<0.01。不同组的运动轨迹图A-G：A组，年轻对照组；B组，成年对照组，未衰老；C组，老年对照组，未处理；D组，维生素E（VE）（0.1 g/kg）处理组，衰老；E组，WGP（2 g/kg）处理组，衰老；F组，WGP（4 g/kg）处理组，衰老；G组，WGP（6 g/kg）处理组，衰老。
3.1.2. 全银杏粉（WGP）对脾脏、胸腺及其他器官指数的影响
与老年对照组相比，D-半乳糖诱导的衰老小鼠的脾脏和胸腺指数较低（图3）。然而，经不同剂量苇谷精处理的小鼠，其脾脏和胸腺指数均有所增加。中剂量全银杏粉（WGP-M）在提高脾脏指数方面效果最佳，而低剂量全银杏粉（WGP-L）和高剂量全银杏粉（WGP-H）在增强胸腺指数方面表现最优。不过，这三个治疗组在脾脏指数和胸腺指数上并无显著差异。此外，对照组和/或苇谷精治疗组的心、肝、肺、肾或脑指数之间无统计学显著差异（图S1）。
3.1.3. 苇谷精对血清和脑中生化参数的影响
与成年对照组相比，D-半乳糖诱导的衰老小鼠（即老年对照组）的血清丙二醛（MDA）和脑中单胺氧化酶（MAO）水平升高（图4）。经不同剂量苇谷精处理后，与老年对照组相比，衰老小鼠的血清超氧化物歧化酶（SOD）水平增加，而血清MDA和脑中MAO水平降低。此外，经WGP-L处理的小鼠脑中MAO水平显著降低。在三个苇谷精治疗组中，WGP-M治疗组的小鼠MDA降低最为明显。
图3. 全银杏粉（WGP）对不同治疗组（A）脾脏指数和（B）胸腺指数的影响。数据表示为平均值±标准差（SDs）（n=10）。
图4. 全银杏粉（WGP）对（A）超氧化物歧化酶（SOD）水平、（B）血清丙二醛（MDA）和（C）脑中单胺氧化酶（MAO）的影响。数据表示为平均值±标准差（SDs）（n=10）。*和#分别表示与成年对照组（B组）和老年对照组（C组）相比，p<0.05；**表示与成年对照组（B组）和老年对照组（C组）相比，p<0.01。
3.1.4. 组织病理学变化
与年轻对照组相比，D-半乳糖诱导的衰老小鼠表现出明显变化：肝细胞出现空泡和脂肪滴，并变得紊乱；肺泡壁明显增厚，结构被破坏；肾囊腔扩大。令人鼓舞的是，经不同剂量全银杏粉（WGP）治疗后，这些病理变化得到了改善（图5）。
3.2. 抗动脉粥样硬化活性
3.2.1. 苇谷精对高脂饮食（HFD）大鼠生化指标的影响
与阴性对照组相比，HFD大鼠的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平显著升高，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著降低（图6）。当用不同剂量的苇谷精治疗时，大鼠的TC、TG和LDL-C水平降低，而HDL-C水平升高。乳酸脱氢酶（LDH）水平略有改善（图S2）。如图6E所示，与阴性对照组相比，HFD小鼠的动脉粥样硬化指数（AI）显著增加（p < 0.01），但经不同剂量苇谷精治疗的小鼠该指数显著降低（p < 0.01）。然而，各治疗组之间无显著差异。
图5. 全银杏粉（WGP）对D-半乳糖诱导的衰老小鼠肝脏、肺脏和肾脏的影响。通过苏木素-伊红（H&E）染色（400倍放大）显示组织学变化。比例尺为50微米。对照组1为60日龄小鼠；对照组2为300日龄小鼠。
图6. 全银杏粉（WGP）对大鼠（A-D）血清生化脂质参数和（E）动脉粥样硬化指数（AI）的影响。数据表示为平均值±标准差（SDs）（n=10）。*和#分别表示与阴性对照组（A组）和高脂饮食（HFD）喂养的小鼠（B组）相比，p<0.05；**和##分别表示与阴性对照组（A组）和高脂饮食（HFD）喂养的小鼠（B组）相比，p<0.01。A组：阴性对照组，老年小鼠；B组：模型对照组，HFD喂养；C组：治疗组，给予1克辛伐他汀（Sim）治疗；D组：治疗组，给予0.5克WGP治疗；E组：治疗组，给予1克WGP治疗；F组：治疗组，给予1.5克WGP治疗。
3.2.2. 组织病理学分析
通过苏木素-伊红（H&E）染色，揭示了治疗对冠状动脉和腹主动脉组织病理学变化的影响（图7）。与阴性对照组的大鼠相比，高脂饮食（HFD）大鼠出现了主动脉增厚、结构紊乱、脂质斑块和内皮损伤。在全银杏粉（WGP）治疗组中，动脉的病理变化得到了改善。
图7. 全银杏粉（WGP）对冠状动脉和腹主动脉的影响。组织学检查通过苏木素-伊红（H&E）染色进行。不同组中的脂质斑块（LP）和内皮损伤（EI）已标出（400倍放大）。比例尺=50微米。
3.3. 抗疲劳活性
3.3.1. 全银杏粉（WGP）对爬杆时间和力竭游泳时间的影响
与阴性对照组相比，经苇谷精（WGP）治疗后，小鼠的爬杆时间和力竭游泳时间均有所延长（图8）。WGP高剂量组（WGP-H）小鼠的爬杆时间和力竭游泳时间分别是阴性对照组的约4倍和1.46倍。
图8. 全银杏粉（WGP）对小鼠（A）爬杆时间和（B）力竭游泳时间的影响。数据表示为平均值±标准差（SDs）（n=10）。*表示与阴性对照组（A组）相比，p<0.05；**表示与阴性对照组（A组）相比，p<0.01。B组：治疗组，给予2克WGP治疗；C组：治疗组，给予4克WGP治疗；D组：治疗组，给予6克WGP治疗。
3.3.2. 组织病理学变化
与阴性对照组相比，经高剂量全银杏粉（WGP-H）治疗的小鼠血乳酸（BLA）水平显著降低（图9），而血尿素氮（BUN）水平略有变化，同时肝糖原（LG）和肌糖原（MG）含量分别显著增加了2.10倍和1.98倍。
图9. 全银杏粉（WGP）对小鼠血液和组织参数的影响。（A）血乳酸（BLA）；（B）血尿素氮（BUN）；（C）肌糖原（MG）；（D）肝糖原（LG）。数据表示为平均值±标准差（SD）（n=10）。*表示与阴性对照组（A组）相比，p<0.05；**表示与阴性对照组（A组）相比，p<0.01。B组：治疗组，给予2克WGP治疗；C组：治疗组，给予4克WGP治疗；D组：治疗组，给予6克WGP治疗。
3.4. 网络药理学
3.4.1. 活性化合物和潜在靶点的筛选
通过TCMSP数据库收集了WGP的活性成分。有15种生物活性化合物符合设定的参数，即口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似性（DL）≥0.18（表S1）。去除重复靶点后，从TCMSP中获得了WGP生物活性成分的270个靶点，并使用UniProt数据库将这些靶点转换为相应的基因（表S2）。我们构建了WGP化合物-靶点-疾病网络（图10），并使用Cytoscape的插件CytoNCA分析了网络的拓扑性质。通过设置三个参数（度、介数中心性和接近中心性）来区分WGP的关键活性成分。根据从大到小的得分排名，确定了前三种关键活性成分分别为槲皮素、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和山奈酚。
图10展示了活性成分与疾病靶点的关系。这些网络包括全银杏粉（WGP）化合物-靶点-衰老网络（A）、WGP化合物-靶点-动脉粥样硬化网络（B）和WGP化合物-靶点-疲劳网络（C）。绿色六边形代表疾病，圆形蓝色矩形代表WGP化合物的靶点，红色圆圈代表WGP活性成分化合物，边代表节点之间的相互作用，深粉色菱形代表WGP配方。
3.4.2. 衰老、动脉粥样硬化和疲劳的靶基因
从四个数据库中获得了与衰老、动脉粥样硬化和疲劳相关的靶点，分别有8163、5716和8301个。通过Venn图分析，确定了124、116和125个交集靶点，这些靶点分别代表WGP活性成分与衰老、动脉粥样硬化或疲劳之间重叠的靶点（图11A-C）。
3.4.3. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和关键靶点的筛选
为了进一步研究特定蛋白质的分子机制和功能，利用STRING数据库构建了三个PPI网络图，即WGP-衰老、WGP-动脉粥样硬化和WGP-疲劳（图S3）。将从STRING检索到的结果导入Cytoscape 3.9.1进行进一步分析，并使用CytoHubba插件筛选出前10个核心基因（图11D-F）。值得注意的是，WGP-衰老和WGP-疲劳的前10个核心基因是相同的。WGP-动脉粥样硬化的前10个核心基因根据得分从高到低排列，分别是FOS、ESR1、MAPK8、JUND、JUNB、FOSL1、FOSB、SP1、CTNNB1和ESR2。
3.4.4. GO功能和KEGG通路富集分析
为了探索WGP潜在的抗动脉粥样硬化机制，进行了GO功能和KEGG通路富集分析。根据FDR<0.05，共有237个GO条目，包括156个生物过程（BP）术语、30个细胞成分（CC）术语和51个分子功能（MF）术语。使用气泡图对这些数据进行了分析，展示了增强程度最高的前10个GO功能（图12A-C）和每个KEGG通路（图12D）。在BP方面，靶基因主要与RNA聚合酶II启动子的转录正调控、基因表达的正调控和对外源性刺激的反应等有关。在CC方面，细胞核是基因比例中占比最大的部分。MF主要由酶结合、相同蛋白质结合、转录因子活性、序列特异性DNA结合等主导。此外，KEGG分析显示，WGP的活性成分可能影响多条通路，包括炎症通路、脂质和动脉粥样硬化以及癌症相关通路。我们还分别对抗衰老（图12E-H）和抗疲劳（图S4）进行了GO和KEGG通路富集分析。对于抗衰老，GO分析共产生了251个项目（p<0.05），其中BP有153项，CC有36项，MF有62项。抗疲劳的GO项目数量与抗衰老相同。我们为前10个GO条目生成了气泡图。我们对具有抗衰老和抗疲劳效果的WGP靶点分别进行了KEGG通路富集分析（p<0.05），抗衰老和抗疲劳产生效果的细胞通路数量相同，总共识别出119条通路。它们主要集中在炎症通路、脂质代谢通路、激素调节通路、细胞衰老通路和癌症相关通路。
图11. 全银杏粉（WGP）的网络药理学分析。（A-C）五谷粉作用靶点与衰老（A）、动脉粥样硬化（B）和疲劳（C）靶点的维恩图。（D-F）cytohubba-MCC反映的蛋白质-蛋白质相互作用网络中确定了五谷粉-衰老（D）、五谷粉-动脉粥样硬化（E）和五谷粉-疲劳（F）基因列表中的核心基因。网络图中的节点大小和颜色与度值正相关。颜色越红、节点越大表示度值越大。
图12. GO富集分析和KEGG通路分析。
（A-D）全银杏粉（WGP）与动脉粥样硬化交集靶点的GO富集分析和KEGG通路分析（FDR≤0.05）。生物过程（前10位，（A））、细胞组分（前10位，（B））、分子功能（前10位，（C））和KEGG通路（前10位，（D））。（E-H）WGP-衰老的GO富集分析和KEGG通路分析（FDR≤0.05）。WGP-衰老的生物过程（前10位，（E））、细胞组分（前10位，（F））、分子功能（前10位，（G））和KEGG通路（前10位，（H））分析。气泡大小代表通路中的靶点数量。气泡颜色表示-log10(p)值的大小。
3.4.5. 分子对接
基于WGP化合物-靶点-疾病网络，筛选出前三大主要活性成分为槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和山奈酚。根据拓扑分析，WGP-衰老和WGP-疲劳的前三个核心基因相同，分别为雌激素受体1（ESR1）、FOS和SP1。WGP-动脉粥样硬化的前三个核心基因为FOS、ESR1和丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。因此，将主要活性成分分别与FOS、ESR1、MAPK8和SP1进行分子对接。结合能值小于-5 kcal/mol表示配体与受体之间存在强结合[34]。WGP的前三大成分（槲皮素、EGCG和山奈酚）能够稳定地与衰老、动脉粥样硬化和疲劳的前四个核心基因（FOS、ESR1、MAPK8和SP1）结合，但EGCG无法与SP1成功对接（图13A-I和S5-S7）。WGP前三大成分与MAPK8的分子结合能比其他靶基因更稳定（表S3）。此外，WGP前三大成分与FOS的分子结合能从低到高依次为-57.10 kcal/mol（EGCG）、-46.73 kcal/mol（山奈酚）和-46.16 kcal/mol（槲皮素）。这表明槲皮素、EGCG和山奈酚更可能通过上述靶点发挥其治疗作用。
图13. 分子对接模拟FOS与全银杏粉（WGP）中三种活性成分（槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）或山奈酚）之间的相互作用。（A-C）FOS与槲皮素的相互作用。（A）FOS-槲皮素复合物的结合构象。（B，C）FOS残基与槲皮素的电相互作用。（D-F）FOS与EGCG的相互作用。（D）FOS-EGCG复合物的结合构象。（E，F）FOS残基与EGCG的电相互作用。（G-I）FOS与山奈酚的相互作用。（G）FOS-山奈酚复合物的结合构象。（H，I）FOS残基与山奈酚的电相互作用。
4，讨论
全银杏粉（WGP）采用专利技术，经过浆料/糊化-脱水/干燥-粉碎/筛分工艺制备而成。该制备工艺节能环保，对人体和环境友好，不添加任何化学添加剂，且易于规模化生产。所得的WGP具有良好的复水性和快速分散于水中的特性，所有营养成分均保留在最终产品中。通过加热可以去除如4′-O-甲基吡啶氧等有毒成分[22,35]。银杏中的活性成分，如黄酮类、萜类内酯、糖类、蛋白质和不饱和脂肪酸，可能有助于发挥其治疗作用[36]。
衰老是一种严重影响生活质量的情况，它会损害感觉和运动功能，并导致器官不可逆性损伤[37]。记忆力和认知能力下降在衰老和与衰老相关的神经系统疾病中很常见[38]。水迷宫测试主要用于评估空间学习能力、非空间辨别学习能力和记忆力，是测量小鼠认知能力的一种有效方法[39]。我们的研究结果显示，服用WGP的小鼠运动量增加，且在目标象限内的时间和距离也更长（图1）。这表明衰老小鼠的学习和记忆能力较差，但服用WGP和维生素E（一种阳性药物）后有所改善。银杏叶提取物在促进轻度认知障碍患者的情景记忆功能以及改善阿尔茨海默病患者受损的认知和记忆能力方面表现出良好的疗效[40]。连续过量注射D-半乳糖会诱导产生过多的活性氧（ROS）和晚期糖基化终末产物表达，最终导致机体氧化损伤[41]。D-半乳糖诱导的衰老模型适合模拟衰老过程，此过程中可能涉及氧化应激和自由基[42]。我们的研究表明，WGP延缓衰老和改善记忆力的作用可能归因于其抗氧化和免疫功能（图4）。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化酶系统中清除过多自由基的重要组成部分[43]。丙二醛（MDA）含量的增加是脂质氧化的自然产物，也是氧化应激的明显特征之一[44,45]。单胺氧化酶（MAO）负责各种生物源性和外源性胺的氧化脱氨作用，并随年龄增长而增加[46]。WGP在提高SOD活性、降低MDA和MAO水平方面发挥了关键作用，从而调节了氧化应激。脾脏和胸腺是重要的免疫器官[47,48]，它们的结构和功能与免疫和退化相关（图3），并随年龄增长而衰退。免疫功能的恶化是衰老的主要原因，脾脏和胸腺指数的增加有助于预防衰老。对照组和/或WGP处理组的心、肝、肺、肾或脑指数无统计学显著差异（图S1），表明WGP未对衰老小鼠造成明显器官损伤或诱导器官损伤[49]。同样，器官病理改变的改善有助于维持身体功能（图5）[50,51]。
动脉粥样硬化是心血管疾病（CVDs）的根本原因，而高脂血症是增加动脉粥样硬化和CVDs发生的主要危险因素之一[52]。高脂血症的特点是血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高，以及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低这一积极指标的减少[53]。因此，功能性材料通过调节脂质代谢和高脂血症紊乱，对预防动脉粥样硬化和CVDs具有有益作用[54]。银杏叶及其提取物已广泛用于治疗CVDs和动脉粥样硬化，其作用机制可能涉及降低血清炎症因子水平、改善冠状动脉循环和减少自由基引起的膜损伤[55-57]。黄酮类和萜类三内酯是银杏中的活性成分，是预防动脉粥样硬化及相关疾病的潜在化合物[36,58]。本研究得出，WGP通过调节LDL-C和TG的升高以及促进HDL-C的水平来发挥降脂作用，与其他抗动脉粥样硬化成分相似（图5和图6）[59]。我们进一步证实，WGP通过抑制动脉粥样硬化初期内皮损伤和粥样斑块的发生来预防动脉粥样硬化及相关CVDs[60]。
运动表现和能量代谢是反映身体缓解疲劳能力的指标。强迫游泳和攀爬测试适用于评估运动表现[61]。WGP显著增加了小鼠的强迫游泳时间和攀爬时间（图7），表明其通过改善运动表现发挥了明显的抗疲劳作用。我们进一步测定了代谢产物含量，以确定WGP是否具有抗疲劳作用（图8）。在高强度运动中，有氧代谢无法满足能量需求，会进行无氧糖酵解[62]。血乳酸（BLA）和血尿素氮（BUN）被认为是评估疲劳的两个参数。BLA是碳水化合物在无氧条件下的糖酵解产物，其积累可能导致代谢功能障碍和疲劳[63,64]。长时间剧烈运动会使身体加速糖酵解，减少糖原储存，并产生乳酸。BLA水平升高会导致肌肉组织和血液中的pH值降低，引起酸中毒，最终导致疲劳产生。BLA水平降低表明具有抗疲劳作用。WGP治疗，特别是高剂量治疗，显著减少了BLA的过度产生和积累。BUN是蛋白质和氨基酸的代谢产物，当糖或脂肪代谢提供的能量无法满足需求时产生。BUN的积累导致肌肉收缩力下降并诱发疲劳[65]。WGP对BUN的影响较小。身体的能量供应以及肝糖原和肌糖原的储存保持稳态，以实现运动的可持续性和身体恢复[66]。我们证实，服用高剂量WGP（WGP-H）的小鼠肝糖原（LG）和肌糖原（MG）含量显著增加，表明WGP为小鼠提供了足够的运动能量储备。
我们鉴定了WGP中15种生物活性化合物与衰老、动脉粥样硬化或疲劳相关的270个共同作用靶点。这些靶点对于治疗衰老、动脉粥样硬化或疲劳可能至关重要（表S2）。使用维恩图分析了WGP与衰老、动脉粥样硬化或疲劳的交集靶点，分别发现了124、116和125个靶点（图9A-C）。生物功能不能由单个蛋白质自主实现，而是通过复杂的蛋白质网络产生的[67]。通过活性成分与三种常见疾病靶点的蛋白质相互作用网络分析，分别鉴定了10个核心基因。FOS、ESR1、MAPK8和SP1是抗衰老、抗动脉粥样硬化和抗疲劳的重要靶点。FOS可以调节血管内皮生长因子的产生，并参与胆固醇（脂质代谢的关键调节剂）的生物合成[68]。FOS/MAPK信号通路抑制M1巨噬细胞极化并促进M2极化，从而抑制和稳定动脉粥样硬化斑块的发展[69]。基质金属蛋白酶-1（MMP-1）是导致胶原破坏的主要蛋白酶，它加速衰老过程。c-FOS（FOS的基因产物）的磷酸化可以减少ROS的产生，下调MMP-1 mRNA蛋白表达，从而延缓衰老[70]。ESR1在血管平滑肌中激活特定的靶基因，抑制平滑肌细胞迁移，并加速内皮细胞生长，从而产生抗动脉粥样硬化作用[71]。下调MAPK8的表达可以通过促进内皮细胞增殖、抑制凋亡和抑制炎症反应来提供治疗动脉粥样硬化的效果[72]。SP1是富含脯氨酸/丝氨酸的卷曲螺旋蛋白1（PSRC1）的上游转录因子，它抑制PSRC1的转录。PSRC1的过表达可以减少巨噬细胞的炎症反应，并延缓动脉粥样硬化的发展[73]。Sp1是端粒去保护诱导的衰老中的抗衰老转录因子。Sp1的下调通过下调核转位导致衰老[74]。同时，我们将WGP的主要活性成分与FOS、ESR1、MAPK8和SP1进行了分子对接。分子结合能结果表明，活性成分与目标基因之间的结合是稳定的。分子机制分析显示，WGP的活性成分对衰老、动脉粥样硬化或疲劳的四个潜在重要治疗靶点（即FOS、ESR1、MAPK8和SP1）具有积极影响。对WGP与抗衰老、抗动脉粥样硬化和抗疲劳的共同靶点进行了GO和KEGG通路富集分析。在主要核心基因FOS、ESR1、MAPK8和SP1中，分别富集了44、8、64和10个KEGG细胞通路。在抗动脉粥样硬化的KEGG细胞通路分析中，我们鉴定了主要与抗炎相关的重要信号通路。共同的抗炎信号通路主要集中在TNF信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路、NF-kappa B信号通路、Toll样受体信号通路和JAK-STAT信号通路上。先前的研究报道，上述抗炎通路通过抑制炎症因子的产生来减缓动脉粥样硬化的进展[75,76]。在抗衰老的KEGG细胞通路分子中，WGP主要通过抗炎（如NF-kappa B信号通路）和代谢（如AMPK信号通路）通路发挥抗衰老作用。抗衰老的分子机制与SIRT1/NF-κB通路的调节有关[77]。AMPK信号通路的激活可以改善骨骼肌的质量和功能，从而实现抗衰老效果[78]。在抗疲劳的KEGG细胞通路分子中，WGP主要通过细胞衰老、凋亡等途径发挥抗疲劳作用。
我们的研究结果证实了WGP的健康益处，并发现了多个潜在靶点和通路。然而，要完全阐明其在体内的作用过程和机制，还需要进行更多研究，如药代动力学研究和成分分布研究。
5，结论
WGP具有抗衰老、抗动脉粥样硬化和抗疲劳的多功能功效。通过实验评估和网络药理学分析，可以从多组分、多靶点和多通路的角度阐述其潜在机制。WGP对D-半乳糖诱导的小鼠具有抗衰老作用，这种作用归因于记忆力的改善、抗氧化能力的增强和器官功能的维持。WGP通过调节脂质紊乱和抑制动脉内皮损伤，减少了高脂饮食大鼠的动脉粥样硬化进展。WGP表现出增强运动表现、调节代谢产物产生或积累以及增加糖原含量以缓解疲劳的能力。综上所述，WGP对衰老、动脉粥样硬化和疲劳具有多功能疗效。本研究鉴定了15种潜在化合物以及分别与抗衰老、抗动脉粥样硬化和抗疲劳相关的124、116和125个靶点。槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和山奈酚是WGP的主要活性
