我们将每天分享国际上生物、医学等方向的最新科研成果，把世界上最新的科技发展带给读者，如果喜欢我们，请点一个关注吧
摘要
减重以改善代谢健康及相关共病是治疗肥胖的首要目标[1,2]然而，保持减重成果是一项巨大挑战，尤其是当身体似乎保留了一种致肥记忆，以抵抗体重变化时[3,4]。由于支撑这一现象的分子机制在很大程度上仍未知，因此克服这一障碍以实现长期治疗成功变得困难重重。本研究中，我们通过单细胞核RNA测序发现，人类和小鼠的脂肪组织在显著减重后均保留了细胞转录变化。此外，我们还发现小鼠脂肪细胞中由肥胖诱导的表观基因组改变持续存在，这些改变对其功能和对代谢刺激的反应产生了负面影响。携带这种致肥记忆的小鼠表现出体重反弹加速，且这种表观遗传记忆能够解释未来在高脂饮食喂养下脂肪细胞转录失调的原因。综上所述，我们的研究结果表明，小鼠脂肪细胞以及可能的其他细胞类型中存在一种主要基于稳定表观遗传变化的致肥记忆。这些变化似乎使细胞在致肥环境中更易发生病理反应，从而导致了节食中常见的“悠悠球”效应（即体重反复增减）。未来针对这些变化的研究可能有助于改善长期体重管理和健康结果。
引言
肥胖及其相关共病构成重大健康风险[1]管理肥胖的主要临床目标是实现显著减重（WL），通常通过严格的饮食和生活方式干预、药物治疗或减肥手术（BaS）来实现[2]。依赖行为改变和饮食调整的策略往往只能带来短期减重，且易受“悠悠球”效应影响，即个体随时间推移会重新增重[3,5,6]。这种反复出现的模式可能部分归因于即使在显著减重[4,7-10]或代谢改善[11-13]后仍然存在的（致肥）代谢记忆。事实上，已有报道指出，小鼠脂肪组织（AT）或基质血管部分（SVF）中存在先前代谢状态导致的持久表型变化，即代谢记忆[14-16]，而在肝脏中这些变化是可逆的[15-17]。还有报道指出，减重后免疫系统的持续改变[18]，以及许多器官内皮细胞中肥胖的转录和功能记忆[19-22]。
表观遗传机制和修饰对于体外和体内脂肪细胞的发育、分化和身份维持至关重要[23-27]，但预计它们也是肥胖细胞记忆的关键因素[4,7]。例如，持续存在的染色质可及性变化已与小鼠髓系细胞中肥胖的病理记忆相关[28]，此外，寒冷暴露研究也表明了（表观遗传）细胞记忆的存在[26,29]。迄今为止，大多数人类研究都集中在分析大块组织或全血中的DNA甲基化，以评估潜在的细胞记忆[30-33]。这些报告可能受到细胞类型组成变化的影响，而细胞类型组成在减重过程中的脂肪组织中特征尚不明确，因此这些研究主要用作细胞表观遗传记忆的指标。
综上所述，单个细胞是否保留代谢记忆以及这种记忆是否通过表观遗传机制传递仍然悬而未决。在本研究中，我们首先通过对显著减重前后肥胖个体以及消瘦、肥胖和曾经肥胖的小鼠的脂肪组织进行单细胞核RNA测序（snRNA-seq），证实了保留的转录变化的存在；其次，我们通过表征小鼠脂肪细胞的表观基因组，揭示了致肥表观遗传记忆的长期持久性，从而着手解决这个问题。
图1 | 减肥手术（BaS）诱导减重后，人体脂肪组织（AT）保留细胞转录变化 a，在减肥手术时（T0）和术后2年（T1）从肥胖患者处采集网膜脂肪组织（omAT）和皮下脂肪组织（scAT）样本。仅纳入与T0相比体重指数（BMI）降低至少25%的个体。从同一研究（MTSS、LTSS和NEFA）中的健康体重/消瘦个体处采集omAT和scAT样本。b，消瘦捐赠者和肥胖捐赠者的性别、年龄、起始BMI和BMI降低情况。c，来自消瘦受试者（n=5；2名男性，3名女性）的omAT池和来自LTSS的T0和T1配对omAT（每组n=5；2名男性，3名女性）的22,742个细胞核的统一流形近似和投影（UMAP）。d，LTSS omAT中高丰度细胞类型中保留的转录变化比例。e，来自消瘦受试者（n=5；2名男性，3名女性）的scAT池和来自LTSS的T0和T1配对scAT（每组n=5；2名男性，3名女性）的15,347个细胞核的UMAP。f，LTSS scAT中高丰度细胞类型中保留的转录变化比例。g，LTSS和MTSS omAT中整合omAT脂肪细胞中保留的转录变化比例。h，omAT脂肪细胞中选定记忆差异表达基因（DEG）的标准化表达。i，LTSS和NEFA scAT中整合omAT脂肪细胞中保留的转录变化比例。j，scAT脂肪细胞中选定记忆DEG的标准化表达。在d、f、g、h、i和j中，使用经Bonferroni校正方法调整的Wilcoxon秩和检验，且差异表达基因的鉴定采用log₂折叠变化（log₂FC）>±0.5。DCs，树突状细胞；EndoCs，内皮细胞；EndoACs，小动脉内皮细胞；EndoSCs，茎内皮细胞；EndoVCs，小静脉内皮细胞；LECs，淋巴内皮细胞；FAPs，纤维-脂肪生成祖细胞；Macro，巨噬细胞；MastCs，肥大细胞；MesoCs，间皮细胞；NeurCs，神经样细胞；SMCs，（血管）平滑肌细胞；NA，不适用；m/f，男性/女性。注：a，版权所有2017-Simplemaps.com（https://simplemaps.com/resources/svg-maps）。
人体脂肪组织的转录变化
为了探究既往致肥状态的特征在人体显著减重后是否持续存在，我们从从未肥胖过的健康体重个体（此处称为健康体重者）和肥胖患者（但无糖尿病）中，在减肥手术（BaS）前（T0）和术后2年（T1）分别采集了皮下脂肪组织（scAT）和网膜脂肪组织（omAT）样本，这些样本来自多项独立研究（图1a）。omAT样本分别来自多中心两步手术（MTSS）研究（n=5名消瘦个体，1男4女；n=8名肥胖个体，2男6女）和莱比锡两步手术（LTSS）研究（n=5名消瘦个体，2男3女；n=5名肥胖个体，2男3女）。本研究仅纳入体重指数（BMI）降低至少25%的患者（图1a、b和扩展数据表1）。我们对每组汇总的omAT进行了snRNA-seq，并基于已发表的数据[34,35,18]，在omAT样本中注释了18个细胞簇（图1c和扩展数据图1a-d），包括脂肪细胞、脂肪细胞前体细胞（APCs）、间皮细胞、免疫细胞和内皮细胞。尽管我们未在T0和T1的omAT中观察到一致的细胞组成差异，但在基于单核苷酸多态性（SNP）的去多重化后，我们观察到了个体间细胞组成的差异，这可能也受到手术期间采样的影响（扩展数据图2e、f）。值得注意的是，细胞类型特异性基因表达分析显示，在两个研究中，T0时（肥胖与健康体重比较）的许多差异表达基因（DEGs）在T1时也发生了失调（图1d和扩展数据图1b、c）。
接下来，我们对来自LTSS研究（n=5名消瘦个体，2男3女；n=5名肥胖个体，2男3女）和NEFA试验（ClinicalTrials.gov注册号：NCT01727245；n=8名消瘦个体，均为女性；n=7名肥胖个体，均为女性）的scAT样本进行了相同的分析，同样仅纳入BMI降低至少25%的患者（图1a、b和扩展数据表1）。我们基于已发表的标志物[34-37]（扩展数据图3a-d），在scAT中注释了13个细胞簇（图1e和扩展数据图1d），包括APCs、脂肪细胞、内皮细胞和免疫细胞。我们未在T0和T1的scAT中观察到一致的细胞组成差异（扩展数据图3e、f）。然而，与omAT类似，我们在两个研究中都发现，许多细胞类型从T0到T1保留了转录差异（图1f和扩展数据图1e、f）。对omAT和scAT中细胞类型特异性基因表达变化的进一步详细分析显示，肥胖期间转录失调在脂肪细胞、APCs和内皮细胞中最为明显（扩展数据图1g-j）。与此观察结果一致，从T0到T1保留的DEGs绝对数量在这些细胞类型中也是最高的（扩展数据图1k）。鉴于每个个体样本中脂肪细胞都强烈保留了转录差异，我们分别整合了来自omAT和scAT研究的所有脂肪细胞的snRNA-seq数据（扩展数据图1l、m），并进行了差异基因表达分析。汇总的omAT脂肪细胞显示出下调DEGs的强烈保留（图1g），包括相关代谢基因[38-41]，如IGF1、LPIN1、IDH1或PDE3A（图1h）。同样，scAT脂肪细胞中下调DEGs的保留也很明显（图1i），并包括相关代谢基因[38,42-44]，如IGF1、DUSP1、GPX3和GLUL（图1j）。对每项研究中脂肪细胞保留的DEGs进行基因集富集分析（GSEA）显示，与脂肪细胞代谢和功能相关的通路持续下调（扩展数据图4a-d），而与纤维化（与TGFβ信号传导相关）和凋亡相关的通路持续上调（扩展数据图4e-h）。这些结果表明，肥胖会在脂肪组织中诱导细胞和转录水平（致肥性）的变化，这些变化在显著减重后并未得到完全解决。
减重后病理生理大多恢复
为了研究这种推测的肥胖代谢记忆的分子机制和病理生理重要性，我们在实验动物模型中评估了减重（WL）的效果（图2a）。6周龄雄性小鼠被喂食高脂饮食（HFD；60%的热量来自脂肪）或低脂谷物饲料（10%的热量来自脂肪）12周（H和C组）或25周（HH和CC_l组）。随后，我们将饲料换为标准谷物饲料（HC、CC_s、HHC、CCC组），导致体重在4-8周内恢复正常（图2b、c）。H组小鼠的葡萄糖耐量受损，但HH组小鼠未受损（与年龄匹配的对照组相比），而HH组小鼠的胰岛素敏感性降低，但H组小鼠未降低（扩展数据图5a、b）。两组小鼠的空腹血糖水平均升高（扩展数据图5c）。减重恢复了HHC组小鼠的胰岛素敏感性，而HC组小鼠仍表现出葡萄糖耐量受损（扩展数据图2d、e）。两组小鼠的空腹血糖水平在减重后均恢复正常，与对照组小鼠相当（扩展数据图2f）。减重后，HC组小鼠的高胰岛素血症得到解决，但HHC组小鼠的高胰岛素血症仅有所减轻（扩展数据图5g-i）。肥胖小鼠中升高的瘦素水平在减重后恢复到对照水平（扩展数据图5j）。减重后，HC和CC_s组小鼠的能量消耗和食物摄入量无差异（扩展数据图5k、l）。HC组小鼠和大多数HHC组小鼠的肝脏甘油三酯积累恢复正常（达到对照水平）（扩展数据图5m、n）。同样，C组和H组小鼠，以及CC_s组和HC组小鼠在去脂体重上没有差异，HC组小鼠也没有失去去脂体重（扩展数据图5o）。肥胖的H组小鼠比相应的对照组小鼠有更大的皮下腹股沟脂肪组织（ingAT）、附睾脂肪组织（epiAT）和棕色脂肪组织（BAT）储存库（扩展数据图5p、q）。ingAT和BAT储存库大小在减重后恢复正常。与最近的一份报告一致，减重后HC组小鼠的epiAT小于对照组[18]。有趣的是，如先前报道的那样[45]，在25周HFD喂养（HH）的小鼠中，在肥胖期间就已经观察到了epiAT萎缩的现象，并且在HHC组小鼠减重后仍然保持（扩展数据图5r-v）。不同储存库的脂肪细胞大小不同，H组和HH组小鼠的ingAT中脂肪细胞增大，在HC组小鼠减重后恢复正常，但在HHC组小鼠中未恢复正常（扩展数据图5w、x）。H组和HC组小鼠的epiAT脂肪细胞也分别增大和缩小到正常大小，而在HH组和HHC组小鼠中，由于组织萎缩，脂肪细胞大小相同（扩展数据图5v、y）。肥胖小鼠（H组和HH组）的epiAT表现出免疫细胞浸润和顶端纤维化，这在HC组小鼠减重后部分改善，但在HHC组小鼠中未改善（扩展数据图5t-v）。Masson三色染色显示，减重后epiAT中胶原沉积增多（扩展数据图5z）。总体而言，减重后，仅持续存在少数轻度代谢障碍，包括HC组小鼠的葡萄糖不耐受、HHC组小鼠的高胰岛素血症和轻度肝脂肪变性，以及两组小鼠减重后epiAT储存库的明显减小。
图2 | 体重减轻（WL）诱导的（部分）表皮脂肪组织（epiAT）重塑伴随持续的转录变化。a，体重减轻研究的实验设置。b，c，18周龄（b）或31周龄（c）的饮食诱导肥胖小鼠或同龄对照雄性小鼠被喂食普通饲料8周。体重（每组n=20；数据来自两次实验）。d，UMAP图展示了来自C、CC、CCC、H、HC、HH和HHC小鼠的综合表皮脂肪组织库（每组n=5只合并小鼠）中的48,046个细胞核。e，每种条件下细胞类型/簇的相对丰度。f，每种条件下巨噬细胞亚簇占总巨噬细胞的百分比。g，h，不同细胞类型中保留的上调（g）或下调（h）转录变化的比例。i，所有条件下脂肪细胞中选定差异表达基因（DEGs）的标准化表达，这些基因未恢复表达谱（左），仅在HC脂肪细胞中恢复（中）或恢复表达谱（右）（Wilcoxon秩和检验，经Bonferroni校正方法调整后的P<0.05；FC>±0.5）。b和c的显著性通过未配对多重t检验计算，并进行Benjamini、Krieger和Yekutieli事后多重比较检验。*FDR<0.001，**FDR<0.0001。确切的P值见源数据。EpiCs，上皮细胞；FDR，错误发现率；FIPs，纤维炎性前体细胞；NPVMs，非血管周围巨噬细胞；PVMs，血管周围巨噬细胞；P-LAMs，增殖性LAMs；W，周。
图3 | 脂肪细胞启动子保留表观遗传记忆。a，AdipoERCre x NuTRAP小鼠体重减轻（WL）研究的实验设置。b，来自一个脂肪组织库的配对CUT&Tag、ATAC-seq和TRAP-seq的工作流程。从冷冻组织中分离出生物素标记的细胞核和GFP标记的核糖体，进行下拉处理，并分别进行CUT&Tag、ATAC-seq（细胞核）和TRAP-seq（核糖体）。c，来自C、CC_s、CC_l、CCC、H、HH、HC和HHC标记脂肪细胞的翻译组（TRAP-seq）的主成分分析（PCA）。每个点代表一个独立的生物学重复样本。d，多维因子分析（MOFA）图显示标记脂肪细胞沿潜在因子1和2（左）的样本聚类以及因子1的值分布（右）。每个点对应一个生物学重复样本。对于每个重复样本，所有六种模式都用一个点表示。e，六种模式之一中每个MOFA因子解释的方差百分比。f，从H到HC，差异H3K4me3标记启动子（y轴）的动力学变化。g，从H到HC，差异H3K27me3标记启动子（y轴）的动力学变化。h，选定基因启动子上H3K4me3（左）、H3K27me3（中）和H3K27ac（右）的标准化富集情况，以及相同基因TRAP-seq与对照比较的对数折叠变化（log2FC）。i，不同条件下Cyp2e1和Icam1基因座上H3K4me3和H3K27me3标准化读数的分布。读数按每百万个转录本（hPTM）进行缩放。NS，不显著；v，与……相比。
图4 | 脂肪细胞增强子保留表观遗传记忆。a，H3K4me1和H3K4me3定量峰与假设的健康对照（每组n=2-3）之间的皮尔逊相关系数（R），带有标准差（s.d.）。每个点代表一个独立的生物学重复样本。b，以H3K4me1标记的量化脂肪细胞特异性增强子的主成分分析（PCA）图。每个点代表一个独立的生物学重复样本。c，从H到HC（左）和从HH到HHC（右）的差异H3K4me1标记增强子（y轴）的动力学变化。d，在不同条件下，以H3K4me1标记的新出现增强子（来自c）相关基因上H3K27ac的状态，通过基因相关H3K27ac峰的存在来确定。左侧n=218，右侧n=127。e，基于WikiPathways数据库，H和HC（左）以及HH和HHC（右）新出现乙酰化增强子相关基因的最显著（重要）通路术语（Fisher精确检验，经Benjamini-Hochberg方法校正后的P<0.05）。f，在HC（n=13；n=72）和HHC（n=7；n=36）中，可通过一种或多种表观遗传模式解释的TRAP-seq中下调和上调记忆差异表达基因（DEGs）的比例。
小鼠中的表观遗传致肥记忆
在确定了人类脂肪组织（AT）和小鼠附睾脂肪组织（epiAT）减重（WL）后肥胖相关转录变化的持续性后，我们将注意力转向了探索赋予这种假定记忆的基础机制。考虑到脂肪细胞的后有丝分裂性质、不动性、长寿命以及在脂肪组织生物学中的核心地位47，我们决定聚焦于脂肪细胞。我们对来自小鼠附睾脂肪组织的脂肪细胞进行了表观遗传分析。鉴于在异质性细胞群体中研究表观遗传特征的固有难度，我们将他莫昔芬诱导的AdipoERCre小鼠与NuTRAP报告小鼠进行杂交，从而在高脂肪饮食（HFD）喂养前用生物素和GFP标记的核糖体标记脂肪细胞核（图3a）。随后，我们开发了一种协议，用于从同一附睾脂肪组织库的标记脂肪细胞中检测多种模式（图3b），并使用靶向纯化多聚体信使RNA（翻译核糖体亲和纯化后进行RNA测序技术（TRAP-seq））、使用转座子可及染色质测序（ATAC-seq）检测染色质可及性，以及使用靶标切割和标记（CUT&Tag）检测四种组蛋白翻译后修饰（hPTMs），对翻译组进行配对分析。本质上，我们从每个附睾脂肪组织样本的脂肪细胞中生成了广泛的表观遗传数据集（扩展数据图8a，b），涵盖了H3K27me3（一种多梳蛋白介导的抑制性hPTM）、H3K4me3（标记活性转录起始位点（TSS））、H3K4me1（指示活性或预备增强子）和H3K27ac（标记活性增强子和其他候选顺式调控元件）48,49。我们观察到标记脂肪细胞的转录谱与通过单核RNA测序（snRNA-seq）鉴定的脂肪细胞簇之间存在强相关性（扩展数据图8c）。与snRNA-seq的观察结果一致，我们还注意到来自HC和HHC小鼠的脂肪细胞中翻译谱的恢复（图3c）。
接下来，为了在我们基于所有条件下所有模式的数据集中识别生物变异性（因子）的来源，我们使用了多组学因子分析（MOFA）50。这使我们能够对配对的多组学（表观遗传）数据集进行无监督整合和聚类，以克服特定模式分析的潜在局限性。沿因子1，HC和HHC样本比对照组更接近于H和HH样本，表明减重并未诱导脂肪细胞表观基因组的完全正常化（图3d）。MOFA将因子1推断为条件间数据变异性的主要来源，其主要受活性hPTMs的影响（图3e）。
受MOFA发现的启发，我们研究了被H3K4me3或H3K27me3标记的启动子，以鉴定这些hPTMs的差异标记启动子（扩展数据图8d）。我们检查了肥胖小鼠和减重小鼠脂肪细胞中这些修饰的动力学。超过1000个启动子在H和HC小鼠中显示出H3K4me3的差异富集（H：1475；HC：1094），其中大多数显示出H3K4me3水平增加（图3f）。同样，859个启动子在HH和HHC小鼠中被差异标记（扩展数据图8e）。总体而言，许多启动子在减重后仍保持活性，而在对照组中这些启动子的标记较少，反之亦然。与H3K4me3相反，在肥胖小鼠中，总体而言，失去H3K27me3的启动子比获得H3K27me3的更多，与对照组相比，相当数量的这些启动子在减重后仍保持抑制状态或未在K27位置重新获得三甲基化（图3g和扩展数据图8e）。
接下来，我们对差异标记的启动子进行了功能分析。与对照样本相比，在肥胖和减重条件下，许多启动子的活性状态发生转换，从活性（H3K4me3和/或H3K27ac）转变为抑制（H3K27me3），或反之亦然。这些表观遗传变化中的许多也反映在翻译组（图3h）和核转录组（图2f）中。保持抑制状态（高H3K27me3和低H3K4me3和/或H3K27ac）的启动子与脂肪细胞功能相关基因（例如，Gpam、Cyp2e1或Acacb）相关，而保持活性状态（即高H3K4me3和/或H3K27ac和低H3K27me3）的启动子则与参与细胞外基质重塑和炎症信号的基因（例如，Icam1、Lyz2或Tyrobp）相关（图3h，i）。通过基因集富集分析（GSEA），我们证实H/HC和HH/HHC小鼠脂肪细胞中H3K4me3的持续存在与趋化因子和炎症过程相关（扩展数据图8f，g）。H/HC受影响基因中H3K4me3持续丢失的包括那些参与脂肪细胞功能（例如，脂肪生成、三酰甘油合成、过氧化物酶体增殖物激活受体信号传导、瘦素和脂联素信号传导）的基因（扩展数据图8f），而在HHC/HH小鼠的脂肪细胞中，脂肪生成相关基因被H3K27me3获得和H3K4me3丢失所抑制（扩展数据图8g），表明脂肪细胞功能持续受损。值得注意的是，相关表观遗传修饰酶的表达在HC或HHC脂肪细胞中并未失调（扩展数据图8h）。
增强子是细胞身份和细胞命运的关键驱动因素51,52。MOFA（图3d）显示，活性（H3K27ac）和增强子（H3K4me1）hPTMs以及染色质可及性（ATAC）是解释所有条件下数据变异性最主要的模式。分析每种条件下hPTM特征与对照组（由健康的年轻对照平均组成）的相关系数，揭示了肥胖或减重条件下H3K27ac和H3K4me1与对照组之间存在较大偏差（图4a和扩展数据图9a）。我们基于数据为每种条件生成了脂肪细胞特异性增强子注释（扩展数据图9b-e），并分析了肥胖和减重小鼠中的增强子动力学。接下来，我们对增强子中的H3K4me1、H3K27ac和ATAC-seq进行了差异富集分析。通过主成分分析（PCA），我们发现对于H3K4me1、ATAC和H3K27ac，HC和HHC样本比对照组更接近于H和HH（图4b和扩展数据图9f-h）。H3K4me1将H/HH和HC/HHC与对照组分开，表明不仅活性增强子，而且预备增强子也可以驱动持续的表观遗传改变。然后，我们分析了肥胖和减重脂肪细胞之间增强子的动态行为。在肥胖期间（H：4255，HH：3237）和/或减重后（HC：3439，HHC：6589），数千个增强子被H3K4me1差异标记，并且从H到HC（n=848）和从HH到HHC（n=857）保持改变（图4c）。
我们将肥胖和减重期间获得（并保持）H3K4me1的增强子称为“新增强子”。这些“新增强子”中的大多数在肥胖和/或减重期间也是活性的（即被H3K27ac标记）（图4d）。然后，我们将增强子注释到其最接近的基因，并进行GSEA。与上述启动子GSEA一致，我们发现“新活性增强子”与炎症信号、溶酶体活性和细胞外基质重塑相关（图4e和扩展数据图9i），表明脂肪细胞持续向更具炎症性和更低脂肪生成性的身份转变。支持这些结果的是，Roh等人分析了肥胖小鼠脂肪细胞中的H3K27ac，并报告了肥胖期间身份维持受损25。
为了将我们关于保留的翻译变化和表观遗传记忆的发现结合起来，我们研究了表观遗传机制（如差异标记的启动子或增强子）是否可以解释减重后持续的肥胖相关翻译变化。值得注意的是，57-62%的下调持续翻译差异表达基因（DEGs）和68-75%的上调持续翻译DEGs可通过一种或多种分析的表观遗传模式来解释（图4f）。总体而言，这些结果强烈表明，小鼠脂肪细胞中存在稳定的细胞、表观遗传和转录记忆，这种记忆在减重后仍然存在。
代谢记忆使脂肪细胞预适应
随后，我们探究了这种持久性记忆是否会使成熟脂肪细胞对营养刺激的反应与非预适应对照组不同。我们从体重减轻（WL）组和对照组小鼠中收集了成熟的皮下脂肪组织（epiAT）和内脏脂肪组织（ingAT）脂肪细胞，培养48小时后评估葡萄糖和棕榈酸的摄取情况。与对照组相比，来自WL组epiAT的脂肪细胞显示出葡萄糖和棕榈酸摄取增加（图5a，b）。来自高脂高碳水（HHC）小鼠的ingAT脂肪细胞葡萄糖摄取显著增加，而在高脂（HC）脂肪细胞中，我们观察到了摄取增加的趋势（扩展数据图10a）。在评估脂肪生成能力时，我们发现，与对照组不同，来自HC和HHC小鼠epiAT的基质血管部分（SVF）在胰岛素刺激下积累脂质但未能分化（扩展数据图10b）。与对照组相比，来自WL小鼠ingAT的SVF脂肪生成能力略有受损（扩展数据图10c）。这些发现表明，持久的细胞记忆在体外赋予了表型后果。
接下来，我们研究了WL组和对照组小鼠对4周高脂饮食（HFD）喂养的反应。HC小鼠的体重增加速度快于对照组小鼠（此处分别称为HCH和CCH）（图5c）。HCH小鼠的空腹血糖水平和餐后胰岛素水平升高（图5d，e），但与CCH小鼠相比，其葡萄糖耐量和胰岛素敏感性并未受损（扩展数据图10d–g）。HCH小鼠的瘦素水平恢复至H小鼠的水平，而CCH小鼠的瘦素水平没有显著增加（图5f）。来自HCH小鼠的epiAT脂肪细胞平均体积更大，与H小鼠的脂肪细胞大小分布相似，而来自CCH小鼠的epiAT脂肪细胞则与对照组小鼠相似（扩展数据图10h）。与CCH小鼠相比，HCH小鼠的ingAT、棕色脂肪组织（BAT）和epiAT脂肪库更大（图5g，h），并且显示出甘油三酯积累和肝脂肪变性增加（扩展数据图10i–k）。
我们对来自HCH和CCH小鼠的epiAT进行了单核RNA测序（snRNA-seq），并观察到与WL时间点相比，HCH和CCH的epiAT中巨噬细胞浸润均有所增加，其中HCH的epiAT中浸润更为严重（图5i和扩展数据图10l）。HCH的epiAT中脂肪组织巨噬细胞（LAMs）的比例更高，与H和HC小鼠相似，而CCH的epiAT与CC的epiAT相比，LAMs的比例也更高，表明在HFD喂养早期就发生了LAM浸润（扩展数据图10m）。
我们评估了HCH和CCH脂肪细胞是否存在转录差异。无论是在HC时间点的先前转录状态还是转录记忆，都无法解释在HCH小鼠脂肪细胞中观察到的转录失调（图5j）。进一步分析发现，HCH组中有几个差异表达基因（DEGs）在肥胖期间发生改变，但在HC小鼠体重减轻后恢复。有趣的是，这些基因与携带表观遗传记忆的启动子和增强子重叠（图2f、3h和5k，l）。更详细的分析显示，表观遗传特征可以解释HCH组中DEGs的数量比HC期间的转录记忆或先前转录状态多3-6倍的原因（图5m）。具体而言，四种组蛋白翻译后修饰（hPTMs）和ATAC-seq可以预测或解释HCH组中31%的上调DEGs（与炎症相关）和60%的下调DEGs（其中许多与脂肪细胞功能和身份相关）（扩展数据图10n，o）。
综上所述，这些发现表明，包括hPTM沉积的局部变化在内的持久性表观遗传记忆，有助于在“悠悠球”饮食模型中脂肪细胞转录反应的改变，并使脂肪细胞对进一步的HFD喂养产生病理性反应，从而促进了小鼠反弹肥胖的病理生理学。其他表观遗传修饰，如其他hPTMs、DNA甲基化或非编码RNA，也可能对观察到的现象有所贡献。
尽管我们在小鼠中进行了严格控制的饮食干预实验，但人类AT样本来自不同的减肥手术（BaS）研究和AT脂肪库，反映了一组整体异质的参与者。确实，BaS是一种成功但具有侵入性的长期减重方法，然而，袖状胃切除术和Roux-en-Y胃旁路术（RYGB）也会影响肠道微生物群、微量营养素吸收、胆汁酸代谢和肠促胰素信号传导。尽管如此，我们在袖状胃切除术（MTSS和LTSS研究）后，该手术诱导了显著减重，以及在RYGB（NEFA研究）后，该手术导致完全恢复至非肥胖或瘦削状态后，均一致观察到AT细胞中保留了转录差异。上述改变以及不同个体和研究之间达到的减重程度是混淆因素，限制了我们的小鼠和人类数据的直接可比性。BaS实现的快速减重甚至可能减少或修改人类AT中的假定细胞记忆。由于目前缺乏从冷冻人类组织中分离纯脂肪细胞核的方法，我们无法在人类样本中进行相应的表观遗传分析。然而，有理由认为，人类中肥胖诱导的转录（和细胞）变化也是通过表观遗传机制介导的，这些机制可以在AT减重后持续存在，并影响人类的（病理）生理学。
图5 | 记忆使脂肪细胞和小鼠对致肥刺激的反应加速。a,b, 分离培养的原代表皮下脂肪组织（epiAT）脂肪细胞的实验。每个点代表三只小鼠合并样本的一个独立生物学重复。a, 葡萄糖摄取。b, 软脂酸摄取。c, 高碳水（HC）和碳水-碳水切换（CC_s）小鼠接受高脂饮食（HFD）4周。体重（每组n=12）。d–g, 高碳水-高碳水（HHC）和碳水-碳水-高碳水（CCH）小鼠的实验。每个点表示两次实验中的一个独立生物学重复。d, 空腹血糖（n=10）。e,f, 饲喂后的胰岛素（e）和瘦素（f）水平（C、H、CC_s、HC：每组n=6；CCH：n=8；HCH：n=5）。g, 肠系膜脂肪组织（ingAT）、皮下脂肪组织（epiAT）和棕色脂肪组织（BAT）的重量，按体重标准化（n=10）。h, 皮下脂肪组织的代表性图像。标尺单位为厘米。i, 相对细胞类型丰度。j, 在HC时间点或转录记忆中差异表达基因（DEG）的状态可以解释的高碳水-高碳水（HCH）脂肪细胞中上调和下调DEG的比例。k, 在HC中恢复但在一种或多种表观遗传模式下仍有差异标记的HCH脂肪细胞中选定DEG的标准化表达（Wilcoxon秩和检验，经Bonferroni校正方法调整后P<0.05；倍数变化（FC）>±0.5）。l, HC和CC_s脂肪细胞在Tmsbx4和Gpam基因座的H3K4me3、H3K27me3、H3K27ac和H3K4me1标准化读取值的分布。读取值按每个组蛋白翻译后修饰（hPTM）进行缩放。m, 可通过表观遗传记忆解释的高碳水-高碳水（HCH）脂肪细胞中上调和下调DEG的比例。在年龄匹配的对照组和实验组之间计算显著性。a、b、d、e、f和g的显著性采用双尾Mann-Whitney检验计算。c的显著性采用未配对多重t检验计算，并进行Benjamini、Krieger和Yekutieli事后多重比较检验。错误发现率（FDR）<0.01，*FDR<0.001。误差条表示标准差。箱线图表示最小值、最大值和中位数。
尽管我们的研究结果并未为脂肪组织（AT）记忆与加速体重增加的全身悠悠球效应之间的因果关系提供最终证据，但Hata等人已证明，将减重（WL）后的皮下脂肪组织（epiAT）移植到对照小鼠体内会通过影响免疫细胞和血管生成而加剧黄斑变性，并且epiAT巨噬细胞在WL28后仍保持改变的染色质可及性。我们对同一组织脂肪细胞的表观遗传分析可以解释这些染色质可及性改变是如何保持的。需要进一步研究以确定，除了脂肪细胞和巨噬细胞28外，其他有丝分裂后细胞或增殖细胞（如肌纤维、神经元或APC）是否也会建立肥胖的表观遗传记忆，并促进观察到的全身性体重反弹效应。尽管我们的研究结果是基于基础科学（BaS）研究得出的，但严格节食减肥的人类受试者体重反弹的易感性也可能与转录和/或表观遗传记忆有关。目前，使用胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂（如司美格鲁肽或替尔泊肽）6,58,59已成为一种有前景的显著减重的非侵入性策略。然而，关于这些激动剂在停药后能在多大程度上诱导人类长期减重和生理变化，目前研究仍不充分。关于司美格鲁肽和替尔泊肽的研究表明，停药后体重会大幅反弹6,59，这表明至少这些治疗并未诱导产生稳定、持久的改变。其他激动剂是否也是如此，仍有待研究。需要进一步研究来阐明，与其他非手术减重策略相比，这些治疗是否能更好地消除或减弱致肥记忆。
脂肪细胞以及可能的其他细胞中存在一种推测的致肥表观遗传记忆，这为改善人类减重维持提供了新的潜在治疗途径。尽管我们的实验集中在肥胖领域，但表观遗传记忆也可能在许多其他情况下发挥作用，包括成瘾性疾病。靶向表观遗传编辑60和表观基因组全局重塑61,62的最新进展提供了有前景的新方法。
