【IF11.2 中科院一区】圣庭医疗联合发表DNA甲基化在结直肠癌发生机制和早筛早诊应用中的研究

结直肠癌（CRC）是全球范围内极为严重的恶性肿瘤之一，其发病率高居第三，死亡率则位列第二。尽管早期原位CRC的五年生存率能达到90%以上，但一旦发展为转移性CRC（mCRC），五年生存率将锐减至14%。值得注意的是，约有一半的原位CRC患者最终会面临疾病转移的风险。CRC的高发病率、递增的死亡率以及当前治疗手段的不足，使其成为一项亟待解决的全球公共卫生挑战。CRC的发生与发展受到多种因素的共同影响，包括表观遗传学改变（如DNA甲基化、组蛋白修饰和核小体重塑）以及基因层面的改变（如肿瘤抑制基因、致癌基因、错配修复基因的突变），同时还涉及染色体不稳定性和微卫星不稳定性等基因组不稳定现象。在这些因素中，异常的DNA甲基化是CRC全病程中最为普遍的表观遗传改变，因此具有在CRC诊断、治疗监测及预后评估中的潜在应用价值。

DNA甲基化（DNAm）是一种稳定的表观遗传修饰，其过程涉及一组DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化作用，在S-腺基甲基苷酸的5’碳位置添加一个甲基（CH3），进而形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。异常的DNA甲基化模式被认为是癌症发展的关键驱动力。癌细胞通常会表现出两个标志性的变化：全基因组DNAm水平的下降以及数百个基因启动子CpG岛上甲基化的增加。与正常结肠组织相比，CRC组织的甲基化水平总体降低约10-40%，但数百个基因启动子的甲基化水平却有所增加。DNAm的失调受多种因素的影响，其中衰老是一个主要的因素。衰老与整体低甲基化和局部高甲基化有关，这可能通过影响肿瘤抑制基因的表达，进而促进CRC的发生。此外，慢性炎症、饮食因素以及环境和生活方式因素也可能通过改变DNAm的模式，促进肿瘤的发生和发展。

图一 DNAm概述

DNAm通过多种机制参与了CRC细胞的增殖和侵袭过程。微卫星不稳定是其中最重要的机制，它能导致错配修复（MMR）基因如MLH1、MSH2、MSH6和PMS2发生突变，或者通过启动子高甲基化沉默MLH1，使DNA错配无法得到纠正，进而促进异常细胞增殖和肿瘤发展。

长散在核元件-1（LINE-1）也是导致CRC中DNAm异常的一个重要因素。在癌细胞中，LINE-1经常呈现低甲基化状态，这会导致逆转录转座子活性的增加和遗传不稳定性，从而加剧CRC的发展。此外，已发掘一系列DNAm生物标志物，如POPDC1和INA。这些标志物的高甲基化会导致其表达降低，进而促进肿瘤细胞增殖和侵袭，并可能诱导CRC细胞发生上皮-间充质转化（EMT），从而进一步加剧肿瘤的恶性程度。这些发现为我们深入了解CRC的发病机制和寻找新的治疗靶点提供了重要的线索。

血管生成为肿瘤生长提供必要条件，并且是肿瘤发生转移的关键因素。目前已有大量证据表明，DNA甲基化与肿瘤血管生成之间存在密切联系。

由LGALS1基因编码的半乳糖凝集素-1（gal-1）在多种癌症，包括结直肠癌（CRC）的进展过程中，对肿瘤血管系统起着至关重要的作用。gal-1是一种关键的促血管生成因子。在CRC细胞中，gal-1的表达受到LGALS1基因启动子高甲基化的调控。当gal-1表达受到抑制时，它会通过促进血管生成以及上调Wnt和NF-κB信号通路，进一步推动肿瘤的增殖。

癌症治疗中面临的耐药性问题日益严峻，其中，DNA甲基化（DNAm）被认为是导致耐药性的关键因素之一。

BRCA1互作基因SRBC的高甲基化可能与CRC细胞对奥沙利铂产生耐药性的机制有关。IMQ作为一种有效的免疫激活剂和TLR8的配体，通过提高启动子的DNAm水平来抑制miR145的表达。这一抑制作用进一步上调了MMP1，导致CRC细胞具备干细胞样特性并对顺铂和多西紫杉醇产生耐药性。此外，MEIS1基因编码的蛋白质在白血病和实体肿瘤细胞的增殖过程中扮演关键角色。该基因的高甲基化与基因表达减少之间存在关联，这进一步促进了CRC细胞的增殖和对奥沙利铂的耐药性。

据统计，高达25%的CRC患者在病情进入转移期时才得以确诊，而超过50%的早期CRC患者在接受手术治疗后，仍面临着复发和转移的风险。随着研究的深入，越来越多的证据表明，DNA甲基化（DNAm）在CRC的转移过程中扮演了关键角色，可能成为治疗的新靶点。

CRC组织中的CPEB1启动子高甲基化与CPEB1的表达水平之间存在负相关，这种关系促进了肿瘤的生长、迁移和侵袭，同时抑制了细胞凋亡。DNA的高甲基化会导致ANGPTL4表达水平降低。这种变化会激活肿瘤相关成纤维细胞，并通过ERK信号通路促进上皮-间充质转化（EMT），从而增强肿瘤的侵袭和转移能力。

大量文献对DNAm在免疫反应中的功能进行了深入研究，结果显示DNAm与肿瘤的起始、进展以及治疗过程中免疫状态的转变存在密切关联。全基因组甲基化分析表明肿瘤反应性CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的甲基化水平有所降低。在原始CD8+ T细胞向肿瘤反应性CD8+ T细胞的转变过程中，免疫相关基因呈现出动态的甲基化变化，这进一步证明了DNAm在塑造肿瘤免疫应答中扮演着关键角色。

图二 DNAm在CRC中的功能和机制

DNAm检测技术已成为探寻CRC筛查与治疗评估生物标志物的重要手段，对于揭示CRC发生与发展的分子机制具有重要意义。在选用合适的DNAm评估方法时，需全面考量成本、耗时及准确性等多重因素。目前，存在三组可区分5甲基胞嘧啶（5mC）与非甲基化胞嘧啶（umC）的方法，具体包括利用甲基化敏感的限制性内切酶、亚硫酸氢钠转化以及基于亲和性的富集策略。

甲基化敏感限制性内切酶（MSRE）系指仅于结合位点含有未甲基化CPG时方可对双链DNA进行切割的酶类。据此，mCs与umCs均可通过甲基化特异性PCR（MSP）以及下一代测序（NGS）技术进行后续深入分析。

基于亚硫酸氢盐转化的DNAm检测技术，是一种在单核苷酸层面评估DNA甲基化状态的重要手段。在亚硫酸氢盐的处理下，未甲基化的胞嘧啶会被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不受影响。亚硫酸氢盐测序技术，作为分析DNA甲基化状态的单碱基分辨率方法，具有高度的全面性和精确性。其中，全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和简并亚硫酸氢盐测序（RRBS）两种方法已被广泛应用于绘制全基因组DNA甲基化图谱。RRBS通过利用如MspI等限制性内切酶，在亚硫酸氢盐处理和测序之前消化基因组DNA，有效降低了基因组的复杂性。相较于WGBS，RRBS具有更快的处理速度、更低的成本和更少的测序需求，因此在大规模研究中展现出更高的实用性和可行性。

亲和富集方法在DNAm分析中占据重要地位。其中，甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）是一种被广泛采用的方法。该技术通过利用特异性抗体沉淀甲基化单链DNA片段，实现了对甲基化DNA区域的富集与测序。另一种值得关注的方法是甲基-CpG-结合域测序（MBD-seq），它依赖于MBD蛋白对甲基化DNA的强亲和力。通过捕获甲基化的双链DNA片段并进行测序，MBD-seq能够生成全基因组范围内的DNAm图谱，为深入研究DNA甲基化提供了有力工具。

第二代测序技术，即NGS，受限于其读取长度，为基因组的组装与结构变异的识别带来了挑战。相较之下，第三代测序技术（TGS）则能够生成数千碱基长度的长reads，并能直接检测到修饰碱基，如5mC和N6-甲基腺嘌呤（6mA）。在生物医学研究与临床实践中，基于纳米孔的测序单分子实时（SMRT）测序和牛津纳米孔技术是最为突出的TGS平台。SMRT测序运用零模波导（ZMW）与荧光标记的核苷酸，能够实时对长达20kb的单个DNA分子进行测序。纳米孔测序则通过检测DNA通过纳米孔时离子电流的变化来识别核苷酸，实现对10至100kb更长reads的实时测序。尽管这两种技术能生成长reads，但其测序成本相较于NGS技术更高，因此在罕见变异识别与DNAm分析中的应用受到一定限制。

肿瘤内部普遍存在的遗传和表观遗传异质性，催生了单细胞DNA甲基化分析技术的不断进步。其中，单细胞亚硫酸氢盐测序（scBS-seq）和单细胞RRBS（scRRBS）是分析单细胞DNAm的关键手段。为了深入探究DNAm变异与其他组学间的关联性，已开发出多种多组学技术。例如，scM&T是一种将同一细胞中的甲基组和转录组测序相结合的方法，通过分离mRNA和基因组DNA，生成scBS-seq和scRNAseq文库，为后续测序提供数据支持。此外，还有类似的协同测序技术，如SMART-RRBS、scM&T和sciTrioseq，这些技术均将单细胞RRBS与RNA测序相结合，以更全面、更深入地解析单细胞内的分子机制。

经过亚硫酸氢钠处理的DNA样本，与含有数千个特定设计的短寡核苷酸探针的微阵列芯片进行杂交。这些探针被设计用于识别甲基化或未甲基化的特定DNA序列。随后，通过荧光标记抗体或其他检测手段，实现对杂交结果的可视化，从而完成基于微阵列的甲基化检测过程。

图三 DNAm的检测和分析方法

癌症的发生与发展过程中，异常的DNA甲基化模式发挥着至关重要的作用。癌症特有的甲基化模式已成为诊断、预测疾病进展以及评估癌症治疗效果的重要生物标志物。

经过对传统诊断方法与基于DNAm的生物标志物进行比较分析，发现基于DNAm的生物标志物在稳定性、可靠性以及无创评估能力等方面具有显著优势。SEPT9基因在CRC中经常呈现出甲基化现象，已有一种针对血液SEPT9甲基化检测的产品获得了FDA的批准，其敏感性介于48%至90%之间，特异性介于73%至97%之间。除此之外，FDA还批准了另一种基于NDRG4和BMP3的DNAm以及KRAS突变和粪便血红蛋白的检测方法，该方法在检测CRC及晚期癌前病变方面表现出更高的敏感性。

DNAm生物标志物已被证实成为预测CRC预后以及监测治疗反应的有效工具。特别是CpG岛甲基化表型（CIMP）与CRC预后不良存在紧密联系，同时，这种联系还受到肿瘤所在位置和微卫星稳定状态的影响。研究数据表明，高水平的CIMP与较差的生存率显著相关，这在直肠癌和MSS肿瘤的案例中尤为显著。

肿瘤中LINE-1元件的低甲基化与CRC患者的不良预后之间存在显著关联。cfDNA中LINE-1的低甲基化与CRC的进展密切相关，这种相关性在肿瘤大小（≥6 cm）、淋巴结晚期（N ≥ 2）和出现远处转移的患者中表现得尤为明显。

此外，肿瘤抑制基因的异常甲基化也与CRC的不良预后有关。例如，CDKN2A基因负责编码两种具有肿瘤抑制功能的p16蛋白，而CDKN2A的超甲基化与CRC患者较差的总生存率密切相关。另一个重要的肿瘤抑制基因RASSF1A的高甲基化也与高CRC风险和低总生存率相关。这些发现为CRC的预后判断和治疗策略制定提供了重要的参考依据。

当前，CRC免疫治疗已取得显著进展，但仍面临若干挑战，特别是在疾病的分子异质性方面。FDA已批准的DNA去甲基化剂，诸如5-氮胞苷和5-氮-2-脱氧胞苷（5-AZA-CdR），在治疗骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病时，通过低甲基化和基因重表达机制，能够激活免疫途径，进而将原本“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，增强其对免疫治疗的反应。此外，研究表明，低剂量地西他滨在重塑肿瘤微环境、提升免疫相关基因表达以及改善肿瘤部位淋巴细胞浸润等方面具有积极作用，从而可增强PD-1抑制剂在MSS CRC中的治疗效果。

图四 DNAm在CRC中的应用