学术发表 | 生信领域顶刊！基于不同测序技术进行全基因组DNA甲基化谱型的比较研究

鉴于Illumina NovaSeq 6000和MGI Tech DNBSEQ-T7的广泛应用，本研究评估了这两种测序平台对全基因组甲基化分析的影响。研究收集了5名骨髓增生异常综合征（MDS）患者和2名健康供体的骨髓（BM）和外周血（PB）样本，并使用不同量的DNA生成了WGBS和RRBS文库：

WGBS文库：（骨髓单个核细胞（BMMNCs）：5、50、100 ng；WBCs：5、50 ng；cfDNA：5、10、20 ng）

RRBS文库：（BMMNCs：2、10、50 ng；WBCs：2、10 ng；cfDNA：2、5、10 ng）

图一 比较NovaSeq 6000和DNBSEQ-T7平台在亚硫酸氢盐测序性能的研究设计

图二 NovaSeq 6000 和 DNBSEQ-T7 平台生成的 RRBS 和 WGBS 数据的测序指标比较

本研究从以下几个指标进行评估：

原始读长质量：DNBseq-T7平台在RRBS和WGBS样本中的平均质量评分高于NovaSeq 6000。NovaSeq 6000的Read 1质量低于Read 2，而DNBSEQ-T7两者之间差异较小。

读长修剪效率：DNBSEQ的低质量末端（Phred < 20）修剪率较低（RRBS: 3%-7%，WGBS: 1%），而NovaSeq较高（RRBS: 10%-35%，WGBS: 1%-6%）。Read 1与Read 2间存在差异。

亚硫酸氢盐转化率（BCR）：两个平台在非CpG环境下的未转化胞嘧啶比例均很低(<1%)，无显著差异。

全基因组亚硫酸氢盐测序重复率： RRBS 难以分辨出因 PCR 而产生的重复reads，无法比较重复率。而在WGBS数据中，DNBSEQ的重复率较低，但差异不显著。

插入片段大小：NovaSeq平台更倾向于长的插入片段，这一现象在RRBS和WGBS文库中都存在。

比对质量：在RRBS的唯一比对到基因组的reads pairs的百分比中DNBSEQ略高（72% vs 66%），而在WGBS上两者相近（68% vs 71%）。

比对错误率：两个平台在RRBS 的错误率相同，但在WGBS上NovaSeq的错误率略高。

CpG位点的覆盖度对于评估测序数据质量至关重要。由于两个测序平台的质量控制指标存在显著差异，所以我们对RRBS数据进行了下采样。

图三 NovaSeq 6000 和 DNBSEQ-T7 之间 RRBS 的覆盖度和甲基化比较

RRBS基因组覆盖率

在至少 1X的测序深度下， 两平台的cfDNA样本的覆盖无显著差别（10%-12%）。BMMNC 和 WBC 样本的覆盖度较低，NovaSeq略高为 6%，DNBSEQ 为4%。

RRBS CpG 位点覆盖率

两个平台之间cfDNA的CpG 覆盖率较为相似，而BMMNC 和 WBC的RRBS 数据CpG 位点的覆盖率存在显著差异。

NovaSeq  (1x: 约600万 , 10x: 260-286万个（42-50%）)

DNBSEQ (1x: 约500万 , 10x: 211-233万个（42-50%）)

在不同样本类型（cfDNA、BMMNCs和WBCs）中，NovaSeq和DNBSEQ两个平台检测到的共享CpG位点数量相当。然而，在BMMNC和WBC样本的RRBS数据集中，观察到平台特异性的CpG位点比例较高。具体来说，NovaSeq平台特异性的CpG位点主要集中在启动子区域，而DNBSEQ平台特异性的CpG位点则更多分布在内含子和基因间区域。

NovaSeq在CGI、启动子和增强子区域的覆盖度均高于DNBSEQ。在整体上，两个平台的CpG甲基化水平存在显著差异。然而，在CGI、启动子和增强子区域，两平台的甲基化水平差异并不显著。DNBSEQ平台显示高甲基化CpG的比例显著更高（55% vs. 42%，P值<0.0001），而低甲基化CpG的比例显著更低（30% vs. 41%，P值<0.0001）。

图四 CGI、启动子和增强子区域甲基化水平

CpG甲基化百分比：DNBSEQ平台的CpG甲基化百分比显著更高，高甲基化CpG的比例显著更高，低甲基化CpG的比例更低。

GC含量覆盖：在GC含量为20%到70%的范围内，NovaSeq的覆盖更均匀且覆盖度更高，显示出对富含GC区域的偏好。

图五 NovaSeq 6000 和 DNBSEQ-T7 之间 WGBS 的覆盖度和甲基化比较

在不同DNA含量的样本中，NovaSeq平台表现出一致的覆盖度和甲基化水平。特别是在CGI、启动子和增强子区域，NovaSeq始终展现出更高的读段覆盖率和更低的甲基化水平。相比之下，DNBSEQ平台的覆盖度和甲基化水平则随DNA含量的变化而有所不同。

在两个测序平台上，对于不同的样本类型和不同DNA输入量的RRBS数据的CpG位点数量都是相似的，且这些样本之间共同的CpG位点数量在这两个平台上也相当。任一平台内常见CpG位点具有高度相关性。而在WGBS中，NovaSeq 的平台内重现性优于 DNBSEQ 平台。对 cfDNA 进行 RRBS 时，这两个平台都表现出稳健的性能。对于基因组 DNA， NovaSeq平台则检出更多的CpG。

图六 RRBS 和 WGBS 的平台内可重复性和平台间一致性的比较

为了评估两个平台识别 DMP 的能力，综合分析了两个平台的MDS 患者和健康供体的 BM 的RRBS数据以及TCGA 数据。DNBSEQ 平台检测到的 DMP 比 NovaSeq 多，两个平台共同检测到的DMR的甲基化趋势一致，与HM450 共同检测的DMP变化趋势基本一致，NovaSeq有少部分具有相反的甲基化状态。两平台DMP 在基因组特征分布相似，在不同 GC 含量上DMP数量分布也具有相似的频率。且启动子区域存在DMP的基因有37.7%的重合，这其中包括5个公认的异常甲基化基因，在MDS患者中均表现出一致的高甲基化，与之前的研究一致 。

图七 两个测序平台之间的 DMP 的性能比较