自本号上一篇谈美国高致病性禽流感疫情的文章已经一个月了。在这一个月里，美国报道有奶牛感染高致病性禽流感H5N1（HPAI H5N1）的州增加到了13个，感染的奶牛群增加到163个，从奶牛感染HPAI H5N1的病人增加到了4例。感染奶牛群最多的克罗拉多州近一周内先后又有两个分别养殖170万和130万只蛋鸡的大型养殖场暴发了HPAI H5N1疫情，为了能够调动更多的资源控制疫情，该州州长还因此宣布了州的紧急状态。至上周五，该州此次捕杀鸡的人员中已有6人确诊感染HPAI H5N1，加上2022年从家禽感染的一例，使美国确诊感染HPAI H5N1的总人数增加到了11人。同时，科学界对H5N1病毒的病原特性研究也取得了一些新进展。现简述如下。![]()
确诊感染HPAI H5N1的奶牛群的州及感染的数量（自USDA）
1.感染奶牛不是美国HPAI H5N1 B3.13基因型特有的特性
在美国奶牛群发生的HPAI H5N1感染，是全球首次发现HPAI H5N1病毒感染牛。其病毒株属于H5N1 2.3.4.4b Clade B3.13基因型。但感染奶牛是不是这一基因型特有的特性，还是其它的H5N1分离株也可以感染呢？为了回答这个问题，德国弗里德里希-洛夫勒研究所（Friedrich Loeffler Institute ,FLI）将自德国野鸟中分离的H5N1病毒株（不同于B3.13基因型）和美国奶牛分离株（B3.13基因型，目前仅在美国流行）分别在动物生物安全3级试验室作了对奶牛的感染试验，最近发布了第一个中期结果。实验证明美国、德国的两个分离株均能够通过乳头直接感染奶牛乳房，均表现出如牛奶产量急剧下降、牛奶稠度变化和发热等明显的症状，与报道的美国奶牛群感染H5N1后的症状相同[1]。说明HPAI H5N1感染奶牛乳腺引起急性病毒性乳腺炎可能是个普遍现象，不是美国目前流行的B3.13基因型特有的。在其它流行HPAI H5N1的国家，也应当做好防止奶牛感染的工作。2．HPAI H5N1感染哺乳动物乳腺是个普遍现象
我们在6月18日的文章中提到过，美国奶牛感染H5N1病毒引起急性乳腺炎，将H5N1奶牛分离株试验接种小鼠，在未处于泌乳期的雌性小鼠的乳腺上皮细胞中也发现病毒[2]，因此推测，哺乳动物的乳腺上皮细胞可能是HPAI H5N1病毒感染的一种靶细胞。最近Nature杂志提前发表的一项研究报告为这一推测提供了新的数据支持。研究人员将今年从美国Texas州一头奶牛分离的H5N1病毒株（暂称为2024 Texas奶牛株），和2005年从越南的一例人身上分离的H5N1病毒株（暂称为2005越南株，该例当时因接触感染H5N1病毒的家禽感染），分别通过鼻腔接种小鼠或雪貂，两株病毒均可在两种动物身上引起呼吸系统以外的其它组织感染，在被感染的小鼠或雪貂的乳腺上皮细胞中均可发现两株病毒感染的证据。这说明，不同年代不同地域分离的不同HPAI H5N1分离株，均有感染不同哺乳动物乳腺上皮细胞的特性[3]。该研究还发现，与奶牛感染类似，泌乳期的母鼠感染后，其乳汁中也排出感染性病毒粒子。通过与感染的泌乳期母鼠接触的成年鼠不被感染，而正在吃奶期的乳鼠被感染推测，病毒非常可能是通过乳汁感染的乳鼠。这有一定的公共卫生意义，如果正在哺乳的女性被HPAI H5N1感染，无论自身症状轻重，暂时停止给婴儿哺乳可能是个明智的选择。3．HPAI H5N1对哺乳动物系统性感染能力
自2021年以来北美和欧洲流行的HPAI H5N1 2.3.4.4b Clade在多个地区感染了除了家禽和野鸟以外的多种陆生和水生哺乳动物，导致多种野生哺乳动物的严重发病和死亡，在这些动物的呼吸系统以外的神经系统、消化系统和泌尿、生殖系统以及肌肉等组织中发现了病毒，表现出了在哺乳动物身上全身系统性感染的特性。最近研究人员通过对小鼠的鼻内感染实验，比较了2024 Texas奶牛株、2005越南株和当前引起季节性流感的H1N1病毒株三株不同病毒对小鼠的感染性。研究发现，感染2024 Texas奶牛株、2005越南株H5N1病毒的小鼠除了呼吸系统以外，在眼、脑、结肠、肝脏、脾脏、肾脏和心脏以及乳腺和肌肉等组织均可检测到病毒。但H1N1病毒则仅在感染小鼠的呼吸系统的组织中检测到。并且，两个HPAI H5N1毒株均可通过口腔和鼻腔感染小鼠并传播到多个系统和组织，形成病毒血症。说明，不同年代、不同地域分离的HPAI H5N1毒株对小鼠均有系统性感染能力。这一点与报道的许多野生动物的感染和部分人感染病例的临床症状或病理变化类似。4．HPAI H5N1 B3.13基因型与受体结合的新特点
能否与人呼吸道上皮细胞中的alpha 2,6唾液酸受体（因其是适应人的A型流感病毒优先结合的受体，故通常称为人流感病毒受体）结合，是A型流感病毒能否感染人上呼吸道的前提，并被认为是评估不同H5N1分离株有没有成为大流行毒株潜力的标准之一。对此前的H5N1分离株的研究发现，它们仍优先结合alpha 2,3唾液酸受体（即通常说的禽流感病毒受体）。为了明确正在美国奶牛群中流行的HPAI H5N1 B3.13基因型毒株的受体结合特点，研究人员将2024 Texas奶牛株与2005越南株和H1N1季节性流感分离株的受体结合特性作了比较，发现H1N1只结合alpha 2,6唾液酸受体(人流感病毒受体)，2005越南株仍是优先结合alpha 2,3唾液酸受体－即禽流感病毒受体，而2024 Texas奶牛株则表现出即可结合alpha 2,6唾液酸受体(人流感病毒受体)，又可结合alpha 2,3唾液酸受体（禽流感病毒受体）的双受体结合特性。也就是说，与2005越南株相比，在受体结合特性上，2024 Texas奶牛株已经表现出了更适应哺乳动物/人的特性[3]。见下图（自文献3），其中Isumi H1N1是一季节性流感分离株，VN1203-H5N1是2005越南分离株，Cow-H5N1是2024 Texas奶牛分离株。![]()
有趣的是，就在几周前，美国CDC公布的对从Texas州那一例与奶牛接触感染的患结膜炎的奶牛场工人身上分离的H5N1毒株(暂称其为2024 Texas 人分离株)的受体结合特性，称其仍只优先结合alpha 2,3唾液酸受体（禽流感病毒受体）。从基因序列上比较，2024 Texas 人分离株与2024 Texas奶牛株二者序列非常接近，也正是基于这一点，认为该例以结膜炎为主要临床表现的病例，是从奶牛感染的。且2024 Texas 人分离株还有了PB2 E627K这一禽流感病毒适应哺乳动物的一个标志性突变。就HA的基因序列来说这两株病毒的受体结合特性应当一致或非常接近，至于为什么CDC的研究结果与Nature杂志报道的研究结果在该毒株受体结合特性上存在差异，是因为研究材料和方法的不同造成的还是有其它原因还不得而知。从报道上看，Nature杂志报道的研究，在相同的条件下，直接比较季节性流感H1N1、2024 Texas奶牛株和2005越南株的受体结合特性的差别，看上去很有说服力[3]。5．实验证明牛可以通过呼吸道感染HPAI H5N1
对于美国目前仍在发生的奶牛群HPAI H5N1疫情，病毒是如何在牛与牛之间传播的一直还不清楚。基于奶牛感染后奶中排出的高滴度的感染性病毒，以及目前疫情报道大多限于正在泌乳期的奶牛等，美国农业部一直认为，病毒是通过污染的挤奶设备等机械地通过乳头感染奶牛的。但这又难以解释不与感染的奶牛场共用挤奶设备的牛场被感染的现实。明确奶牛和一些非泌乳的其它牛有没有可能通过其它途径感染，对于疫情控制有着重要的实际意义。最近，Biorxiv上一预印本文章报道，用不同途径人工感染非泌乳期的荷斯坦一岁小母牛和泌乳牛的实验结果。研究人员分别将小母牛通过气溶胶呼吸道途径接种，对奶牛通过乳房内途径接种，两种情况下牛均可被感染。虽然小母牛通过气溶胶呼吸道途径接种后的临床疾病症状较轻，但通过呼吸道病毒检测、病变及血清学检查均证实了感染，而且小母牛呼吸道分泌物中可检测到病毒（虽然病毒量比牛奶中的低）。该实验证实了牛可以通过呼吸道途径感染，并可通过呼吸道分泌物排出病毒，至于这种症状轻微的非泌乳牛感染对当前病毒在牛群中和牛群间传播中起着什么作用还不清楚。对泌乳牛人工感染造成的临床疾病包括瘤胃蠕动下降、牛奶外观改变和产量降低，与奶牛场病毒性乳腺炎的现场报告一致[4]。6．当前的HPAI H5N1在哺乳动物间通过呼吸道传播的能力
此前报道的哺乳动物感染HPAI H5N1病例，大部分是散发的个别病例。但是去年西班牙貂养殖场、南美洲海洋哺乳动物发生过的大规模感染和发病，以及目前正在奶牛群中流行的疫情，说明HPAI H5N1病毒感染哺乳动物后，一定条件下有在哺乳动物群中广泛传播的能力。至于是哪种途径传播的，目前仍倾向于直接接触传播。既然HPAI H5N1 Texas奶牛株已经表现出了对人和禽流感受体的双受体结合特性，理论上它感染人或哺乳动物的上呼吸道纤毛上皮细胞在与受体结合这一步应当没有了障碍。据据报道，Michigan州出现的一例从奶牛感染的人病例，以及克罗拉多州上周确诊的6人感染病例中的部分病例，有了典型的上呼吸道感染症状，说明了当前的H5N1毒株对人上呼吸道的感染能力。值得注意的是，Colorado州上周确诊的6例人病例，虽然是在捕杀鸡的过程中感染的，但从上传到GISAID的部分病例分离株的HA、NA和PB2的序列进化树分析（见下图），均与奶牛分离株在一个进化枝里，所以，Colorado州这两个大型蛋鸡场暴发的毒株很可能正是在奶牛群中流行的毒株，至于病毒是怎么从奶牛群传染给养鸡场的，现在还没有流行病学上的证据报道。![]()
在过去报道的人感染病例中，曾经有过与感染病例接触的家人或医护人员被感染、发病，或虽然未发病但产生了抗H5的抗体(血清发生阳转)，说明H5N1在人与人之间曾发生过有限的传播。如果能通过呼吸道途径有效传播，就会容易发生大范围的流行。因此，有了呼吸道感染症状的人，能不能在人与人之间通过呼吸道有效传播就成了人们关注的重点。由于雪貂呼吸道流感病毒的受体种类和分布与人相似，且雪貂感染流感病毒后的症状和免疫反应也与人类似，所以雪貂是当前比较公认的与人最接近的流感病毒感染和传播动物模型。研究人员将2024 Texas奶牛株与H1N1季节性流感分离株，分别感染雪貂后，将未感染的雪貂放进已被人工感染的雪貂的同一个笼子内让它们直接接触，2024 Texas奶牛株(H5N1)与H1N1季节性流感分离株均能高效地传播给未被人工感染的雪貂。如果将人工感染的雪貂放在一个笼子里，将未被感染的雪貂(暂称为实验雪貂)放在另一个笼子内，但两个笼子相距5厘米，使雪貂之间不能直接接触但感染雪貂产生的气溶胶和呼吸道飞沫可以通过空气到达实验雪貂的笼子。结果发现，感染H1N1株的雪貂可以将H1N1病毒有效传播给实验雪貂，而与H5N1感染雪貂相距5cm的另一笼子的4只实验雪貂没有被感染的症状，但有一只产生了抗H5的抗体[3]。说明2024 Texas奶牛株在这一动物模型中通过呼吸道传播的效率当前还比较低，尚未获得高效地通过空气传播的能力。当然，病毒能否通过呼吸道途径有效传播，除了与呼吸道上皮细胞上的受体结合有关以外，与直接影响病毒与受体结合后发生内化的pH值，病毒在细胞内的复制效率，以及产生和能够从细胞表面释放出感染性子代病毒的量等均直接相关，而目前还不清楚2024 Texas奶牛株在雪貂动物模型上通过呼吸道传播的限制因素主要在那一步。7．HPAI H5N1能不能引起流感大流行
自HPAI H5N1在1997年引起人的感染、死亡事件以来的20多年内，它能不能引起流感大流行一直是人们关注的一个热点。一部分人认为，自人类有清楚历史记载的、有确定病毒亚型的流感大流行以来的100多年内，引起人类流感大流行的毒株只有H1，H2和H3三个HA亚型 (即1918年的H1N1,1957年的H2N2,1968年的H3N2,1977年的H1N1和2009年的H1N1)，100多年内没有发生过H5亚型的大流行，所以以后也不会。持谨慎态度的另一部分人认为，基于流感病毒的多变性以及HPAI H5N1自1996年以来的演化趋势，很难排除有这种可能。回头看早期的一些H5N1病毒分离株和重组株在雪貂这一动物模型中的感染性、致病性和直接接触传播的效率均比较低[5-7],但最近的HPAI H5N1 2.3.4.4b clade对雪貂的感染性和致病力却显著提高。在同一个笼子内直接接触传播的效率达到100%，且部分表现出了通过空气传播的能力[8,9,3]。CDC从Texas感染的人身上分离的毒株，西班牙貂分离株（也是2.3.4.4b clade）和智利人分离株(Clade 2.3.4.4b)均可在同一个笼子里通过接触100%感染实验雪貂。不同笼子里呼吸道传播试验中Texas人分离株对实验雪貂1/3也发生了感染[10,9] 。由于这些研究用于呼吸道传播试验的实验雪貂数量均比较有限(每个实验也就有3、4只)，因此，有限的数据很难确切地知道目前的流行株通过呼吸道传播的效率到底有多少，但实验结果至少已知说明，该毒株已经有部分地通过呼吸道感染和传播的能力。早期对H5N1病毒的研究发现，只要改变其HA上四个氨基酸和PB2上一个氨基酸，或用H1N1的除了HA以外的7个基因组节段替换H5N1的相应基因组节段，就能在雪貂模型中实现通过空气有效地传播[11,12]。而且这些氨基酸的改变，单个或其中几个均在自然界中分离的H5N1禽流感病毒中发现过，只不过还没有完全出现在一株病毒上。理论上只要病毒有足够的时间在哺乳动物中演变，就不能排除病毒将这些突变积累到同一株病毒上的可能，或者还有未被人们认识的其它突变也可能导致相同的生物学功能，实现有效的在哺乳动物间通过呼吸道传播。因此，从同一个健康的角度出发，同时加强人和动物HPAI H5N1的疫情监测，对于及早发现有大流行潜力的毒株有着重要的公共卫生意义。从人类过去已知的H5N1病毒暴发和流行的历史看，HPAI H5N1还没有一次在与人关系如此密切的家畜-牛群里如此大规模和长时间的流行过。去年西班牙水貂养殖场的疫情通过集中捕杀很快就扑灭了。但美国自3月份开始确诊的（可能去年年底就开始了）奶牛群中HPAI H5N1疫情规模之大和当前采取的措施控制效果之差，导致目前仍然看不到疫情被控制的迹象。根据联合国粮食和农业组织FAO的一个报告的，不算其它种类的牛，2024年3月仅美国农场中的奶牛数量估计就有933万头，分布在大约两万个农场中。如果疫情持续得不到控制，这么大的易感动物群会给病毒更多的演化机会。假如疫情发生在其它国家，美国大概早就站在道德制高点上开始叫了，要求别人及时公开信息、采取更强有力的措施等。可反观美国，上周确诊有奶牛场感染疫情的第13个州Oklahoma，样品居然是4月份采集的，不知道什么原因3个月后才公布检测结果，更别指望这三个月内该州采取了哪种像样的控制措施了。而农业部早期公布的动物身上分离的病毒基因序列滞后严重，且与序列有关的流行病学信息支离破碎，遭到想通过基因序列追踪疫情的学者的广泛批评。再看看CDC对人的监测和检测，目前为止累积确诊感染的奶牛场达到160多个，这些农场与感染家畜直接接触的人数不知道有多少，而CDC实际检测的人数一共才检了60多人，且都是有感冒样症状的、自愿检测的。采用的检测手段也是只有PCR对样品进行病毒核酸的检测，没有血清学检测，因此也无法知道到底有多少人感染过，以及有没有无症状感染和传播的可能。这种现状受到美国国内、欧洲及其它地区一些专家或同行的强烈批评，他们在Nature和Science杂志上也多次呼吁美国应当采取更有力的措施监测并尽快控制住疫情，表达病毒可能进一步适应哺乳动物进而感染引起人间流行的担忧，但目前还未看到有什么明显的改进。无论HPAI H5N1病毒是否有演变为大流行毒株的可能，包括美国在内的多个国家已经开始为可能的大流行作抗病毒药物和疫苗的准备了。CDC跟踪检测了病毒对现有抗流感病毒药的敏感性，以及疫苗候选株对当前流行株的保护效力等。7月初，美国健康与公众服务部(Department of Health and Human Service, HHS)通过其生物医学先进研究与开发局(BARDA)宣布，向Moderna公司提供1.76亿美元，用于开发一种预防H5禽流感的疫苗。据报道Moderna公司的针对H5和H7亚型的流感疫苗2023年已经开始了临床1/2期试验，今年将出来结果，2025年将进入三项临床。同时， CSL Seqirus公司生产的首批480万剂H5亚型佐剂疫苗(用细胞培养病毒的方法生产) 7月份交付给美国。欧盟6月份也已经为其15个成员国从CSL Seqirus订购了4千万剂的H5亚型疫苗，首批已经在芬兰提供给了与动物接触的一线人员使用。同时，美国也在权衡给奶牛接种疫苗与可能带来的相关奶制品的贸易限制的利弊。总之，以目前的方式和政策措施使疫情能够短期内消失的希望渺茫，我们只希望别看到病毒进一步向着可引起大流行的趋势演变。参考文献
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