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近日，Phytopathology以封面文章发表了吉林农业大学李玉院士团队题为“Characterization, Pathogenicity, Phylogeny, and Comparative Genomic Analysis of Pseudomonas tolaasii Strains Isolated from Different Mushrooms in China”的研究论文。
研究背景
蘑菇是营养物质和药物的宝贵来源，也是许多企业稳定的收入来源。商业蘑菇的生产受到病虫害的限制，其中由不同种类的假单胞菌或多种非假单胞菌引起的细菌性斑点病是蘑菇的主要病害，其在不同种类的蘑菇中表现的症状差异很大，包括棕色斑点、姜斑、滴鳃斑、黄色斑点等。该病害导致蘑菇菌盖或菌柄的变色和毁坏，影响其质量和产量，从而导致巨大的经济损失。
在能够导致蘑菇细菌性斑点病的物种中，托拉氏假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii）通常会导致双孢蘑菇、大肥菇、金针菇、香菇、杏鲍菇和平菇的斑点病。细菌斑点病分布于较大的地理区域，发病率逐年不同。在中国，与蘑菇斑点病相关的细菌种类的特性、多样性和致病性仍然未知。因此，使用已在其他领域应用的常规技术和广泛的分子技术，包括多位点序列分型、基因组测序和比较基因组分析，将有助于阐明中国致斑点细菌的多样性。准确了解致斑点细菌的发生、遗传多样性、分布和致病性，对制定诊断策略、培育新品种和防治蘑菇细菌性斑点病具有重要意义。
原文链接：
https://doi.org/10.1094/PHYTO-12-20-0550-R
研究结果
1、受侵染蘑菇的症状和病原细菌分离、鉴定：在2016~2019年在中国上海、吉林、福建、贵州、山东、北京、辽宁的26个受调查的蘑菇农场和工厂中，有85%的蘑菇出现了细菌性病害症状。金针菇的症状为菌柄黑腐，严重情况下，金针菇的整个菌柄出现黑色腐烂（图1 A）。平菇和双孢蘑菇的菌柄上观察到棕色斑点或棕色凹陷斑（图1 B, C）。蛹虫草的症状包括原基生长受抑制和子实体发育不良（图1 D）。双孢蘑菇褐斑病的发病率为0~5%，蛹虫草生长受抑制的发病率为0~3%，金针菇黑根病的发病率为2~12%，平菇褐斑病的发病率为1~8%。通过形态学特征鉴定（图1 E-H）、科赫氏法则验证（图1 I-L）、生理生化特征鉴定、16S rRNA和tolaasin生物合成基因鉴定，共鉴定托拉氏假单胞杆菌102株。
图1 托拉氏假单胞杆菌侵染蘑菇的自然发病症状（A-D）、病原细菌形态特征（E-H）和致病性测定（I-L）
2、托拉氏假单胞杆菌寄主范围测定：选择4株高致病性分离自金针菇、平菇、蛹虫草和双孢蘑菇的托拉氏假单胞杆菌（Pt11、Pt51、Pt53和Pt75）进行更广泛的寄主范围试验。4株菌株分别接种于12种不同类型的蘑菇。所有菌株在金针菇的菌柄和菌盖上导致黑腐（图2 A），在黄色金针菇的菌盖上导致深棕色斑点（图2 B）。在白色和棕色双孢蘑菇菌盖上均出现棕色斑（图2 C, D）；侵染斑玉蕈菌盖导致浅棕色凹陷斑（图2 E），侵染羊肚菌菌柄导致棕色斑（图2 F）；侵染平菇引起褐斑病（图2 G）；侵染灰树花、榆黄蘑、红平菇、杏鲍菇和秀珍菇引起褐腐病（图2 H-L）；在蛹虫草上引起子实体生长受抑制（图2 M）；在人工接种条件下，托拉氏假单胞杆菌不侵染黑木耳、毛木耳和银耳（图2 N-P）。托拉氏假单胞杆菌菌株在检测寄主中表现出不同程度的症状。在致病性和宿主范围试验中，接种无菌蒸馏水的对照蘑菇没有出现症状。从接种发病子实体中重新分离出的细菌具有与原接种细菌相同的形态和生化特征，并通过16S rRNA和tolaasin生物合成基因的扩增和测序证实。
图2 托拉氏假单胞杆菌寄主范围测定
3、MLSA：rpoB基因树内的物种聚类与组合基因和其他个体基因树一致，但有一些P. tolaasii与P. costantinii和P. “reactans”在一个分支中。在组合基因树中的P. tolaasii分支被聚为A和B两组，具有100%的引导支持值（图3）。A组的P. tolaasii菌株可分为3个亚群（A1、A2和A3），并按其地理位置进行聚类。例如，双孢蘑菇上分离的中国本地菌株和国际菌株（德国、荷兰和英国）分别聚在一起（图4）。此外，A1亚组主要根据其在中国的具体位置进行分组。例如，来自吉林长春和山东淄博的分离自金针菇的P. tolaasii在系统发育上存在差异。然而，也有少数情况是，来自不同地点的菌株按寄主或分离年份聚集在一起。
图3 从管家基因的部分序列连接（glns、gyrB、rpoB和rpoD）构建的托拉氏假单胞杆菌和其密切相关的假单胞菌物种的最大似然树
图4 圆形分枝图代表了本研究中使用的102株托拉氏假单胞菌的管家基因：glns、gyrB、rpoB和rpoD连接序列构建的最大似然树
4、基因组特征和系统发育：将Pt11、Pt51和Pt53菌株（PRJNA683147、PRJNA683167和PRJNA683171）分别组装成含有1、52和36个contigs的全基因组序列。从NCBI基因组数据库中下载了13个基因组，并对这16个基因组进行了质量检测。16个基因组的大小为6.48~7.01 Mbp，16株基因组的contigs的数量为1~357个。17（PMS117）为60.2%，（Pt11）为60.75%。GC含量在P. tolaasii （PMS117）中的60.2%和P. tolaasii （Pt11）中的60.75%之间变化。rRNA和tRNA的范围分别为2~16个基因和54~68个基因。预测的编码基因范围为5699~6338个。与参考菌株P. tolaasii（NCPPB 2192）相比，16个基因组的ANI和dDDH值分别为98.91~100.0%和93.5~100.0%。核苷酸同源性高于普遍接受的物种发育的临界值（ANI和dDDH值分别为95%和70%）。
利用MLSA、TYGS服务器树和4个连接的管家基因构建的wgMLST树重建系统发育树，发现16株MLSA属于一个单系群（图3）。wgMLST树将16株托拉西氏菌菌株分为3个聚类。簇I组组成了Pt51菌株。簇II和簇III分别由7个和8个菌株组成。TYGS树和wgMLST树得到了高引导值的支持。
5、泛基因组分析：泛基因组拟合累积曲线显示，随着更多基因组的加入，核心基因的数量保持相对稳定在5000个，特有基因的总数继续增加，没有迹象表明它很快就会接近渐近线（图5 B）。扩展参数“B”为 0.129，表明P. tolaasii泛基因组是开放的。图5 C显示了系统发育树与所有P. tolaasii菌株的核心和辅助基因生成的矩阵的比较。
图5 使用Roary pipeline对16个托拉假单胞菌菌株进行泛基因组分析
6、比较基因组分析：通过比较基因组学分析表明托拉氏假单胞杆菌具有分泌系统、毒力因子、碳水化合物活性酶、毒素、次级代谢产物等多种与致病相关的假定基因，这些基因与发病机制相关，并帮助寄主适应不同的环境。在菌株中编码的插入序列、整合子和噬菌体可能有助于基因组的可塑性、毒性和抗生素耐药性。这些发现促进了对毒力决定因素的理解，有助于靶向有效控制细菌性斑点病。
李玉院士在沈阳农业大学植物保护学院培养的2021届已毕业博士刘正慧为该论文的第一作者，在吉林农业大学培养的博士后Frederick Leo Sossah为该论文的共同第一作者，李玉教授和李丹为该论文的通讯作者，毕业硕士研究生赵一橦、Benjamin A. Okorley，在读博士生刘培斌，Daniel G. Amoako（南非德班夸祖鲁-纳塔尔大学健康科学学院抗菌研究室）和Hongyan Sheng（美国华盛顿州立大学植物病理学）也为该论文的发表做出了重要贡献。该工作得到灵芝种质资源的建立与新品种的培育与开发（GF20190034)；国家自然科学基金项目（31700012）；长春科技项目（15SS11）；“111”蘑菇作物种质资源创造与利用项目（D17014）的资助。
团队或作者简介
通讯作者：李玉，男，1944年出生，山东济南人，汉族，中共党员，中科院理学硕士，日本筑波大学农学博士，中国工程院院士，俄罗斯科学院外籍院士，全国脱贫攻坚楷模。吉林农业大学教授、博士生导师，食用菌新种质资源创制国际联合研究中心主任，国际药用菌学会主席，国务院学位委员会第四届、第五届学科评议组成员，国家食用菌产业技术创新战略联盟首席科学家、国家援助赞比亚农业技术示范中心首席科学家，《菌物研究》主编，国家级有突出贡献的中青年科技（管理）专家，国家教学名师，第二届全国创新争先奖状获得者，获得“全国脱贫攻坚楷模”、“全国优秀教育工作者和科技工作者”、2021年“粮食英雄”、“全国科普人物奖”、“最美科技工作者”、“全国科技助力精准扶贫2019年度先进团队”、“全国专业技术先进集体”、“全国农业植物保护先进个人”、“新中国70年·长春70人”等荣获称号。
李玉院士从1978年开始研究菌物，已在教育和科技战线辛勤耕耘了近40年，挖掘了大量菌物资源，构建了全新的菌物系统分类体系，将基础理论与应用技术相结合，创立了“菌类作物学”。以创新成果为依托，研究解决食用菌工程技术难题，先后主持并带领团队完成国家和省部级菌类工程研究项目如国家科技部、农业部、“973”、“863”、“948”以及国家自然科学基金国际合作重点及面上项目等国家和省部级项目50余项，累计科研经费过亿元，促进了菌物科学的发展及食用菌产业化升级。
在学术刊物上发表论文上千篇，其中173篇被“SCI”收录或引用，出版著作30余部。获得国家已授权发明专利20余项，国家自然科学二等奖1项、教育部高等学校科学研究优秀成果奖（科学技术）科技进步奖一等奖1项、国家教学成果二等奖1项、全国创新争先奖1项、何梁何利基金科学与技术进步奖1项、戴芳澜终身成就奖1项、中国植物病理学会终生成就奖1项、吉林省科技进步一等奖3项、二等奖2项、三等奖10余项，对我国的菌物事业做出了突出贡献。
