体外科学116-良好体外实验室规范与运行-细胞篇1-纯洁性

在生物医学研究和检验检测领域，体外细胞培养技术应用广泛。良好细胞操作规范是确保实验准确性和科研成果可靠性的指导性要求。目前，细胞实验中普遍存在真实性和纯洁性两大问题，具体表现在：

1、溯源性：细胞来源不清楚，专利归属存疑；

2、遗传背景：普遍缺少遗传相关检测数据，存在重编程现象；

3、记录：细胞复苏、冻存、传代等信息不全或缺失；

4、身份标志：特征性参数无鉴别或不明；

5、污染：真菌、支原体的污染；

6、形态：存在病变和不一致；

7、行为：贴壁率，倍增时间无核查；

8、基因操作：生物安全；

9、影响因素：缺少监管和风险分析。

     本系列依据GCCP（Good Cell Culture Practice，良好细胞培养规范）和GIVIMP（Good In Vitro Method Practices，良好体外方法规范），依据ISO17025实验室认可准则的要求，结合华代生物体外实验室认可体系运行6年多的经验，在资深CNAS评审员程树军博士指导下，将分多期探讨这一话题。

     细胞纯洁性和真实性是细胞检测中的核心要素。细胞的纯洁性意味着它们未被污染，保持原有的遗传和生理特性；而真实性则确保细胞系身份的真实无误，避免交叉污染和误用。这些特性直接关系到实验结果的准确性和科研进展的顺利与否。

【图1 全自动微生物液滴培养系统示意图】

根据GCCP标准，无菌是细胞培养的基础。传统的无菌检查方法耗时长，而快速无菌检查法则提供了一种高效的替代方案。这种方法通过验证其专属性、检测限、耐用性和重现性，确保细胞培养过程中无菌状态的维持。例如，全自动微生物液滴(MMC)培养系统，基于液滴微流控技术进行微型化、自动化、智能化的高通量微生物培养。每个微滴单元的体积仅2-3μL，可进行350~800nm全波长扫描和荧光激发检测，并实时检测微生物的生长情况。

   【图2 单细胞测序流程】

     GIVIMP标准强调对细胞系进行遗传学、形态学或功能特性的定期鉴定。

严格操作规程：建立健全的细胞培养操作规程，确保操作人员在无菌、无污染的环境下进行细胞培养。严格遵守实验室规章制度，如穿戴实验服、戴手套、使用无菌工具等。

定期细胞鉴定：定期对细胞系进行遗传学、形态学或功能特性的鉴定，确保细胞系的身份和特性未发生改变。这包括使用分子生物学方法（如STR分型、SNP分析）进行细胞系身份验证。

采用新技术手段：利用先进的生物技术手段，如单细胞测序、CRISPR基因编辑等，对细胞系进行精准鉴定和改造，提高细胞系的纯度和稳定性。这些技术不仅能验证细胞的身份，还能确保其遗传特性未发生改变。

    在GCCP和GIVIMP标准指导下，建立完善的细胞库管理制度至关重要，这包括详细记录细胞系的来源、保存条件和使用记录，确保存储、复苏和传代过程符合规范要求，避免交叉污染的发生。

【图3 细胞库管理系统示意图】

强化培训与监督：定期对实验室人员进行细胞培养技术和生物安全知识的培训，提高其对细胞系交叉污染的认识和防范能力。同时，加强对实验过程的监督和检查，及时发现并纠正潜在的污染风险。

细胞培养污染的来源：人的体表、衣物和环境空气中都含有大量微生物，它们是可能的污染来源。因此，除了对操作人员严格规定和具体要求外，还应对培养环境，包括操作室、培养箱、操作台(生物安全柜或超净工作台)进行洁净监控，做好风险防范和管理。

【表1 细胞培养的污染来源】

定期对细胞库的细胞进行质检：在实验室细胞培养中，支原体污染是一个常见且严重的问题，它会影响细胞的生长和实验结果的准确性。在常见的8种污染支原体中，口腔支原体(M. orale)、精氨酸支原体(M.Arginini)、猪鼻支原体(M.Hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(A.Laidlawii)4种所占污染比例超过95%。

【表2 细胞培养中的主要支原体及可能来源】

      传统的支原体检测方法包括PCR检测、荧光显微镜观察、培养检测等，但有时候需要寻找优化方法来检测支原体污染，以下是一些推荐的检测方法：

1）DNA分子杂交技术：

原理：利用已知的支原体DNA序列制备特异性探针，与待检细胞样品中的DNA进行杂交，通过检测杂交信号来判断是否存在支原体污染。

优点：具有较高的特异性和灵敏度，能够快速准确地检测出支原体污染。

2）电镜检查：

原理：使用扫描电镜或透射电镜直接观察细胞样品中的微生物形态，包括支原体。

优点：直观、准确，能够直接观察到支原体的形态和分布。

3）支原体培养法：

原理：将待检细胞样品接种在特定的培养基上，观察是否有支原体生长。

优点：虽然耗时较长，但能够培养出支原体并进行进一步的鉴定和分型。

4）预防与清除支原体污染的措施

除了检测方法的选择外，预防和清除支原体污染同样重要。

【图4 支原体污染扫描电镜图】

【图5 支原体克隆呈典型的“煎蛋”形态】

严格无菌操作：

在细胞培养过程中，严格遵守无菌操作规范，如穿戴适当的实验室服装、使用无菌技术等。

定期更换培养基和细胞传代，保持细胞活力。

定期清洁和消毒：对细胞培养箱、生物安全柜等设备进行定期清洁和消毒，确保内部环境干净卫生。

使用支原体清除剂：如发现支原体污染，可使用支原体清除剂进行处理，如MRA（Mycoplasma Removal Agent）等。根据污染程度和细胞类型选择合适的处理浓度和时间。

支原体污染的危害：支原体被认为是细胞培养的“吸血鬼”，除了消耗营养、细胞病变之外，在分子水平上，支原体经常激活NF-κB（活化B细胞的核因子kappa-轻链增强子）的炎症反应，并同时抑制p53介导的反应，后果是触发细胞周期和凋亡。与此同时，支原体通过其膜脂蛋白（LAMPs）和脂蛋白衍生物（MALP-2）能够通过核易位和激活Nrf2干扰细胞炎症反应。可见，支原体污染细胞后的作用是多方面的，严重干扰细胞实验结果。

随着生物技术的不断进步、科研需求的日益增长，以及行业高水平产品研发的需要，基于广义的细胞培养及检测试验操作的实验室已成为必然趋势。运行体外科学实验室，应严格遵守GCCP和GIVIMP标准，以确保检测结果的准确性和可靠性。在国内尚未建立完善的体外实验室认可制度之前，应参照执行ISO17025的有关规定，对于初次申请CNAS认可的实验室应确保体系有效运行6个月以上。细胞操作是体外实验室的基本功，稳定地保持体外培养物的纯洁性和真实性是所有体外实验的共性要求，实验室质量体系应严格作出规定并遵照执行。  

本系列还将陆续介绍相关要求和先进经验，敬请期待....

参考文献：

[1] 程树军.化妆品替代方法标准实施指南.中国标准出版社,2017

[2]OECD (2018), Guidance Document on Good In Vitro Method Practices (GIVIMP), OECD Series on Testing and Assessment, No. 286, OECD.

[3] Pamies, D, Leist, M, Coecke, S, et al. Guidance document on Good Cell and Tissue Culture Practice 2.0 (GCCP 2.0). ALTEX.2022;39:30–70.

[4] Eskes C, Boström AC, Bowe G, et al. Good cell culture practices &in vitro toxicology. Toxicol In Vitro. 2017;45(Pt 3):272-277.

[5] Cöllen E, Tanaskov Y, Holzer AK, et al. Elements and development processes for test methods in toxicology and human health-relevant life science research. ALTEX. 2024;41(1):142-148.

【未完待续】