与巨头对话毒理学
香精香料产业全球发展
【接上期】
PeBiToSens平台是国际香精香料巨头奇华顿开发的完全用于取代生态毒理学评估中的动物试验，是其用于研发更安全和环境友好的新型香味香料成分的关键核心技术。
三
PeBiToSens平台
2、替代体内生物浓度因子的体外生物转化方法
化学物质的生物浓度是鱼类通过鳃从水中吸收化学物质之后的净累积结果，包括通过鳃的排泄、生物转化和粪便排出的全过程。生物转化可以减少化学物质在鱼体内积累的程度，从而形成具有较高水溶性的代谢物，最终可被生物体排出。在缺乏体内BCF数据的情况下，体外研究通常采用基于log Kow的预测模型，即化学品的亲脂性来预测。当log Kow < ca.7时，log Kow与鱼体内的被动生物积累之间存在良好的线性相关关系(图1)，在这种情况下，该化学物质不被生物转化。目前在环境毒性领域，已经建立了多个基于QSAR的生物转化率筛选模型，但化学物质在鱼体内的生物积累仍然是重要的有待阐明的主要生态毒性问题之一。
[图1 Kow与BCF的线性QSAR模型]
2.1
鳟鱼肝脏S9体外生物转化试验
目前有两种体外方法已经完成国际环形验证，两项方法是虹鳟鱼肝脏S9亚细胞组分试验（RT-S9）和肝细胞试验。使用肝细胞或RT-S9进行生物转化酶消耗底物的试验，采用HPLC-MS或LC-MS等方法分析试验化学物质的减少量。验证研究表明，这两种检测方法在确定体外生物转化率方面具有高度的可靠性，2018年OECD TG 319A和B将列入测试指南。
2.2
体外-体内外推模型
体外-体内外推（IVIVE）模型可用于预测BCF，并考虑了鱼类的特定生理参数，以完善BCF预测。目前最常用的IVIVE模型预测是Nichols建立的标准鱼类模型，体重为10 g的虹鳟鱼，饲养温度15°C，全身脂质含量为5%。考虑到血流速率的影响，要把通过RT-S9检测中确定的生物转化率转化为全身生物转化速率常数（kB，或kMET）。该模型还包括一个校正因子（fU），以校正可能存在的蛋白质结合效应。
2.3
RT-S9试验预测香味成分的BCF
利用上述模型研究预测30种化学品（其中23种香味化学品）的BCF，即基于体外S9数据预测体内的BCF，结果表明预测值比体内测量值平均高6.8倍，但使用校正因子可以有效改进(图2)。
[图2 用RT-S9方法预测两个风味异构体的生物转化]
[图3 预测鱼体生物积累的替代方法概念模型]
水生生物中化学吸收和消除的主要途径可以概括为以下速率常数的函数：食物吸收（kD）、鳃吸收（k1）、鳃吸收（k2）、代谢转化（kM）、粪便排出量（kE）和生长稀释（kG）。ADME:吸收、分布、代谢和排泄；BCF:生物浓度因子；KOW:辛醇-水分配系数；QSAR:定量构效关系。
3、鱼类急性毒性替代实验
3.1
环境毒理学领域替代脊椎动物试验的范围
出于动物福利的原因，只有符合REACH法规附件VIII和年产量超标的化学物质才需要进行该项试验。根据3R原则，急性鱼类毒性试验按照OECD指南203描述的阈值方法。作为鱼急性毒性试验的替代方法，鱼胚胎急性毒性试验（FET）和短期鱼卵和胚胎孵育试验，是两项可以使用的替代方法。欧盟2010/63/EU法规认为除青年期和成年期之外的鱼卵和胚胎为非保护的生命阶段。
3.2
鱼鳃细胞试验
许多化学物质能够与鳃组织中的细胞膜相互作用，进而导致鱼的死亡。化学物质与细胞膜的非特异性相互作用是一种类似麻痹的作用模式。这种简单的作用模式在亲脂性化学物质如香味化学品中特别普遍。基于上述原理，可以利用体外培养的鳟鱼鳃细胞系RTgill-W1，将单层细胞暴露在不同浓度的化学物质中24小时，用三个不同的终点检测细胞活性，分别代表不同的非特异性细胞毒性机制，即代谢活性、细胞膜完整性和溶酶体完整性(图5,6)。该方法2021年被OECD认可为指南249。
[图6 三种细胞毒性的原理]
3.3
香料物质的测试
基于37种香料成份的结果见下表，得出的回归方程如图7。
[图7 香味成分RTgill-W1细胞毒性与鱼急性毒性的相关性]
未完待续
参考文献
[1]程树军.化妆品替代方法标准实施指南,标准出版社,2017
[2] OECD. No. 280, ‘Guidance Document on the determination of in vitro intrinsic clearance using cryopreserved hepatocytes (RT-HEP) or liver S9 subcellular fractions (RT-S9) and extrapolation to in vivo intrinsic clearance’, Series on Testing and Assessment, OECD Publishing, 2018.
[3]Laue H, Natsch A, et alChemistry and the Environment.2020.168–175.
[4]Burden N, Benstead R, Benyon BK,et al. Applying the 3Rs in fish acute toxicity tests—Environmental Toxicology and Chemistry, 2020;39:2076–2089
[5] OECD.TG249.Fish Cell Line Acute Toxicity: The RTgill-W1 cell line assay,2021
3R和仁慈准则被翻译成多种语言影响全球
背 景
奇华顿（givaudan）1768年创始于瑞士，是一家拥有250多年历史的跨国香精香料公司，旗下拥有风味与健康、香氛与美容两个事业部。目前，奇华顿在全球多个国家都拥有分支机构和生产工厂，在世界香精香料行业中处于领先地位。
Heike Laue博士
Heike Laue博士是奇华顿公司体外分子筛选团队高级科学家。2009年加入奇华顿，主要参与了环境安全评估的替代方法的开发、实施和验证，特别关注于生物积累。另外还从事哺乳动物体外代谢香味成分的研究。
[苏黎士奇华顿总部外景及中厅]
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