在现代生物医学研究中，细胞实验扮演着至关重要的角色。无论是基础的细胞培养、基因编辑，还是复杂的细胞信号传导研究，都离不开高质量的细胞样本。因此，确保细胞的真实性和质量，对于研究的准确性和可靠性至关重要。GCCP(Good Cell Culture Practice，良好细胞培养规范)和GIVIMP(Guidance Document on Good In Vitro Method Practices, 良好体外方法规范）作为国际公认的细胞培养与验证标准，为细胞实验室提供了明确的指导和规范。
GCCP标准强调细胞培养过程的合规性、质量控制与风险管理，以确保细胞的真实性和活性。GIVIMP标准则更侧重于体外方法的过程管理，与GLP原则保持一致，包括10部分内容：
--利益相关方（开发者、验证者和和使用者），
--质量保证和质量控制，
--资源和影响因素，
--仪器材料和试剂，
--试验系统，
--试验和控制要求，
--SOP，
--运行过程，
--结果报告，
--记录保存。
在整个体外方法的良好运行中，细胞真实性评价有助于实现对细胞操作的全面质量控制，包括细胞的形态、功能、活性等指标的检测和评估。这有助于确保确保细胞试验的可重复性。
在GCCP和GIVIMP标准下，良好细胞实验室的细胞真实性评价不仅是对细胞质量的保障，更是对生物学研究准确性和可靠性的承诺。通过综合运用多种评价方法和技术手段，我们可以确保细胞样本的真实性和质量，为生物学研究的发展贡献力量。
使用在线数据库，如ATCC和DSMZ，查询已知的细胞类型，验证细胞系的真实性。
细胞形态观察：细胞形态学观察是细胞真实性评价的基础方法。通过显微镜观察细胞的形态、大小、核仁数量及位置等特征，可以初步判断细胞的种类和状态。然而，形态学观察易受主观因素影响，且不同细胞系间可能存在形态上的相似性，因此不能作为唯一判断依据。
[图1细胞形态学分类原则]
细胞膜完整性检测：采用流式细胞术等方法检测细胞膜的完整性，确保细胞未发生破裂或损伤。
无菌检测：采用适当的检测方法（如培养法、PCR法）对细胞培养物进行无菌检测，确保无细菌、真菌等微生物污染。
污染控制：建立严格的污染控制流程，包括实验室环境控制、无菌操作技术、培养物处理等，以降低污染风险。
内毒素检测：内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的成分，在细胞培养过程中可能因细菌污染而产生。采用凝胶法、浊度法、显色试验等方法对细胞培养物中的内毒素进行检测。对检测出的内毒素进行风险评估，并采取相应措施（如更换培养基、优化培养条件）以降低其含量。
细胞系鉴定是对细胞系质量进行评估和控制的手段之一。鉴定过程可以验证细胞系的真实来源和身份，确保其与原始样本或已知细胞系的一致性。这有助于避免细胞系的交叉污染、混淆或误用，提高实验的可重复性和可靠性。可以确认细胞的纯度，即确保培养中的细胞不受其他细胞类型的污染。
细胞遗传学分析：如染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）等，可以揭示细胞的遗传信息，从而判断其真实性和纯度。特别是FISH技术，能够针对特定的染色体区域进行标记和检测，对于识别细胞系中的染色体异常和交叉污染具有重要意义。
[图3荧光原位杂交结果图]
细胞分离与保存
采用适当的分离方法（如酶解法、机械分离法）从组织中分离细胞，确保细胞的纯度和数量。通过差速离心、流式细胞术等方法对细胞进行纯化，去除杂质和不需要的细胞类型。
建立严格的细胞操作规范，包括无菌操作、细胞传代、冻存与复苏等，以确保细胞在操作过程中保持活性和完整性。根据细胞类型和应用需求设定适当的保存条件（如温度、湿度、气体环境等），以确保细胞在保存过程中保持活性和稳定性。
细胞活力检测方法
ATP生物发光法：测量细胞内ATP水平来评估细胞活性，具有高灵敏度和宽动态范围。
LDH检测法：通过测定培养基中LDH的活性来评估细胞的损伤或死亡程度。
MTT比色法：通过测量活细胞中脱氢酶的活性，将MTT还原成紫色的甲瓒产物，间接反映细胞的代谢活性。
CCK-8法：CCK8全称Cell Counting Kit-8试剂，可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。该试剂中的WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
[图5 CCK-8原理]
荧光染料法：利用特定的荧光染料，如Calcein-AM或CFSE，来标记活细胞，通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。
细胞凋亡检测：通过Annexin V和PI染色，检测细胞表面的磷脂酰丝氨酸外化，评估细胞凋亡的程度。
随着基因编辑技术的成熟，高敏感、高表达和易检测基因序列的操控，使得用于毒性测试的转染细胞成为替代方法的一大趋势。目前OECD认可的稳定转染报告基因的方法，包括皮肤致敏、免疫毒性和内分泌干扰三个终点，如：
---TG442D附录1A皮肤致敏的KeratinoSens方法，
---TG444A用于免疫毒性筛查的细胞方法，
---TG456用于稳定转染人雄激素受体的转录激活堃法检测化学的雄激素激动剂和拮抗剂活性，
---TG455基于性能的稳定转染反转录激活雌激素受体激动剂和拮抗剂的方法，
---TG493基于性能的人重组雌激素受体（hrER）体外试验检测具有ER结合亲和力的化学物质的试验,
下面以KeratinoSens方法所用细胞为例，说明等同或优于该细胞的转染细胞的设计要求。
1、ARE-Nrf2荧光素酶试验
1.1 细胞要求
ARE-Nrf2荧光素酶试验应使用与皮肤致敏过程相关的转基因人类细胞系(如角质形成细胞、树突状细胞和其他相关细胞)且稳定插入荧光素酶报告基因。
1.2基因要求
荧光素酶报告基因在人AKR1C2（人源重组蛋白）基因的ARE元件或替代ARE元件的控制下，被皮肤致敏剂上调。如果使用含有替代ARE元件的细胞系，则应证明所选ARE元件对Nrf2的特定依赖性以及报告基因活性对Nrf2的依赖性。方法可选择在报告细胞系中暂时或永久地灭活Nrf2活性，也可通过验证致敏剂诱导的荧光素酶活性由于Nrf2表达的减少或丢失而降低。
1.3转染要求
应证明转染的细胞具有稳定的荧光素酶报告基因插入。克隆的选择应基于性能，例如基于荧光素酶诱导光输出的最佳信噪比，以及当细胞用弱致敏剂处理时荧光素酶诱导的最高动态范围。
1.4实验要求
应确定最佳细胞接种数量以及培养基组成(如DMSO、FCS)，以确保皮肤致敏剂(包括弱致敏剂)获得显著的荧光素酶诱导。还应评估受试物的细胞毒性。
2 荧光素酶试验的基本步骤
2.1 细胞的准备
测试使用的细胞应为80-90%融合。在测试前一天，收集细胞，并以1×104个细胞/孔的细胞密度接种到96孔板中。在接种时应避免细胞沉降，以确保细胞在孔中均匀分布。
[图6 体外细胞转染关联到激活共同的信号通路]
2.2 受试物和对照的制备
受试物和对照品应在测试当天溶解在DMSO中，制备成所需浓度（对于没有定义分子量的测试物质宜制备成40 mg/mL或4%(v/v)的储备液）。使用合适的溶剂（DMSO、无菌水和培养基）进行连续2倍稀释，以获得12个测试浓度。
2.3 细胞毒性测试
细胞毒性测试采用MTT法，应避免测试体系（如比色、染料）和测试物质（如颜色、还原剂效应等）等因素的干扰。在48 h暴露时间后，将培养基替换为含有0.5 mg/mLMTT的新鲜培养基，在37±1 °C和5%CO2环境下孵育2 h。然后除去MTT培养基，使用适当的溶出剂，例如10%(质量体积分数)十二烷基硫酸钠和0.4%(体积分数)醋酸DMSO溶液，在震动足够时间后测量吸光度，计算细胞活力。
2.4 荧光素酶试验
细胞在96孔板中培养24h后移除培养基，改用新鲜培养基，并加入50µL受试物/对照品。在受试物/对照品暴露48h后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，并将用于荧光读数的相关裂解缓冲液添加到每个孔
中，保持足够时间(例如在室温下20分钟)。然后将含有细胞裂解液的板放置在光度计中进行读取，其步骤为：a）将荧光素酶底物添加到每个孔(即50μL)；
b）等待1s；
c）整合荧光素酶活性2s。
3 标准方法的性能
3.1重复测试
对于每种测试化学品和阳性对照物质，需要进行一次运行来得出预测(阳性或阴性)，包括至少两次独立测试，每个测试包含三个平行(即n=6)。如果两次独立的测试结果不一致，应进行第三次测试，包含3个平行(即n=9)。分批次进行独立重复测试，使用新鲜的测试化学品原液和独立采集的细胞。每次测试的培养板至少有一个孔是空白(没有细胞，没有处理)，以评估基准值。
3.2 荧光素酶活性测试
荧光素酶活性测试采用发光检测法，以下因素是确保适当的发光读数的关键因素：
a）灵敏光度计的选择；
b）使用有足够高度的平板，以避免光线交叉污染；
c）使用具有足够光输出的荧光素酶底物，以确保足够的灵敏度和低变异性；
d）适当和稳定的基准值。
3.3 可接受标准
在进行荧光素酶试验时，应满足以下验收标准。如果不满足下面列出的任何条件，则应丢弃数据并重新测试。
a）至少有一种测试浓度（在4-64 µmol/L中），阳性对照肉桂醛获得的荧光素酶活性诱导应在>1.5的阈值（例如使用t检验）中具有统计学意义。
b）阳性对照的EC1.5应在定期完成的两个测试的历史平均值的标准差范围内（例如，在基于验证数据集的7 µmol/L-30 µmol/L之间）。此外，在64 µmol/L时，肉桂醛的平均诱导倍数应在2~8之间。如果不满足后一个标准，应仔细检查肉桂醛的剂量反应，只有当阳性对照在增加浓度的同时诱导增加荧光素酶活性，呈明显的剂量反应时，才可接受试验。
c）每次重复时，溶剂对照（即DMSO)的发光读数的平均变异系数应低于20%。如果可变性较高，则应丢弃结果。
[图7 报告基因插入位点]
【本节内容为华代生物主持起草的上海市毒理学会团体标准（T/SHSOT004.3-2024）《体外毒性试验标准方法优化 第3部分 皮肤致敏性测试的ARE-Nrf2荧光素酶试验方法》，有修改】
参考文献：
【未完待续】
