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一、OECD 2024年新增和更新化学品测试指南
TG253 大型水蚤保幼激素短期活性筛选试验(JHASA)，
TG252 (日本青鳉)体内快速雌激素活性试验(REACTIV)，
TG321 端足虫生物浓度试验(HYBIT)。
另有3项更新方法，涉及健康毒理学中的皮肤致敏感、眼刺激及其组合，分别是：
OECD 332D测试指南2024版阐述了AOP皮肤致敏通路的第二个关键事件（KE2）下的体外分测试方法，即角质形成细胞活化事件。测试指南在原有的两种体外ARE-Nrf2荧光素酶测试方法的基础上，增加了一种基于基因表达的定量测试方法，即ARE-Nrf2荧光素酶KeratinoSens
测试方法（附录IA），ARE-Nrf2荧光素酶LuSens测试方法（附录IB），表皮致敏试验EpiSensA（附录IC）。
首先，TG442D列出的3项KE2方法均不能单独使用，也不能将根据UN GHS定义将测试物区分为皮肤致敏1A和1B，也不能用于安全评估决策中致敏效力的预测。但是，根据测试目的和监管框架的不同，这些方法产生的阳性结果可以单独用来将一种化学物质分类为致敏物。
其次，指南中的3项方法其试验程序、适用领域和局限性均不相同，但每个方法的结果对于阐明角质形成细胞激活的关键事件都是有帮助的。
1、原理
EpiSensA方法用于阐明皮肤致敏的KE2角质形成细胞激活，其方法是通过致敏物暴露于重建人类表皮（RhE）模型后，检测炎症反应和细胞保护两类重要通路的标志基因表达的量化变化：激活转录因子3（ATF3）和白细胞介素-8（IL-8）基因的表达反映了角质形成细胞的炎症反应，而谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基（GCLM）和DnaJ（Hsp40）同源亚家族B（DNAJB4）基因的表达反映了细胞保护基因通路的诱导。标志基因的相对变化可使用逆转录定量PCR（RT-qPCR）的方法进行检测。
2、验证
EpiSensA测试方法中使用的重建表皮模型是LabCyte EPI-MODEL24。其他模型也可以使用，但应通过并满足性能标准的要求，具体可参考OECD导则文件396。
两个参与实验室的实验室内重现性分别为93.3%（14/15）和86.7%（13/15）。在三个参与实验室对27种测试化学品的分析中，计算出的实验室间重现性为88.9%。验证结果表明，与LLNA结果相比，EpiSensA预测致敏剂的准确性为83.3%（120/144），其中敏感性为88.8%（95/107），特异性为67.6%（25/37）。与人类的结果相比，EpiSensA的准确性为80.7%（71/88），敏感性为98.1%（53/54），特异性为52.9%（18/34）。
3、适用范围
目前可用的数据表明，EpiSensA测试方法适用于测试有机官能团、反应机制、致敏能力和物理化学性质不同种类的化学物质。EpiSensA适用于测试可溶性化学品或在适当的溶剂中形成稳定分散的化学品。由于使用了重建的三维模型，因此，可以用于测试亲脂性化学物质(如logKow > 3）。
4、局限性
一些表面活性剂由于ATF3和IL-8基因的非特异性表达，可能导致假阳性结果。此外，使用蒸馏水作为载体测试高浓度（如100%或50%（w/v）），可以诱导高渗透胁迫条件，导致ATF3的非特异性表达。
5、过程
EpiSensA方法检测表皮模型暴露化学物质6小时后，采用RT-qPCR方法定量分析4个与角质细胞激活相关的标记基因的定量表达，即ATF3，GCLM，DNAJB4，IL-8。同时进行细胞毒性评估，以确定标记基因的表达上调是否发生在亚细胞毒性浓度（细胞活力≥80%）。将标记基因的相对诱导量与对照组进行比较。如果至少有一个标记基因的表达超过各自的临界值（ATF3为15倍，GCLM为2倍；DNAJB4为2倍，IL-8为4倍），则认为检测化学物质为阳性。简要流程图如下：
1）细胞毒性试验：采用LDH法；
2）预试验确定浓度：采用24孔板筛查，见下表；
3）RNA提取和RT-PCR测试：
4）预测模型：
【早在2017年华代生物通过实施国际合作项目，根据文献开展EpiSensA试验，经验丰富，细节可咨询文后联系方式】
[1]OECD.2024.Test Guideline No. 442D In Vitro Skin Sensitisation Assays addressing the Adverse Outcome Pathway Key Event on Keratinocyte activation.
[2]Natsch A, Ryan CA, Foertsch L,et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology 33, 337-1352.
[3] Ramirez T, Mehling A, Kolle SN,et al. (2014). LuSens: a keratinocyte based ARE reporter gene assay for use in integrated testing strategies for skin sensitization hazard identification. Toxicol In Vitro 28, 1482-1497.
[4] Series on Testing & Assessment No. 383: Epidermal Sensitisation Assay (EpiSensA)Peer review Report; OECD.
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