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5个 WB 细节，教你拿到漂亮图

学术 2024-11-05 21:42 山东

小编整理了 5 个 WB 实验细节技巧，带你从细节手法出发，优化 WB 实验结果。5个 WB 细节，带你靠自己的双手，拿到漂亮图！

样本切记煮沸勿偷懒

煮沸的首要目的是使蛋白质完全变性，即破坏蛋白质的三级和四级结构，使其展开成线性形式。

这样，蛋白质分子在电泳过程中的迁移速率将主要取决于它们的分子量，而不是它们的构型差异。

将样本与加载缓冲液按 1:1 比例混合将混合后的样本在沸水浴中煮沸 5 分钟，这个步骤可以确保蛋白质的变性。

煮沸过程中，SDS-蛋白质复合物的形成更加均匀，有助于蛋白质在凝胶中的一致性迁移。

煮沸后立即将样品置于冰上冷却，这一步是为了终止变性过程，防止蛋白质在高温下过度降解或重新聚集。

加载缓冲液的成分：0.5M Tris-HCl pH 6.8

作用：提供一个稳定的 pH 环境，有助于蛋白质在电泳过程中保持稳定。

加载缓冲液的成分：2% SDS

作用：SDS 与蛋白质结合，形成复合物，使其带负电荷。

加载缓冲液的成分：10% 甘油

作用：增加样品的黏度，有助于样品在凝胶孔中的均匀分布。

加载缓冲液的成分：0.01% 溴酚蓝

作用：作为追踪染料，帮助观察样品在电泳过程中的迁移情况。

加载缓冲液的成分：5% β 巯基乙醇

作用：有助于破坏蛋白质中的二硫键，进一步促进蛋白质的变性。

通过这些步骤，可以确保蛋白质在凝胶电泳中的表现更加一致和准确，从而得到可靠的实验结果。

电泳条件需谨慎遵循

电泳条件对于 Western Blot 实验的成功至关重要，因为它们直接影响蛋白质的分离效率和结果的清晰度，但是很多同学会「凑合用胶」，没有完全根据目标蛋白大小选择合适的凝胶浓度和电泳条件。

不过也要注意，电压推荐是针对恒定电压条件下的电泳，实际使用时应根据凝胶的尺寸、电泳槽的类型以及具体的实验条件进行调整。

另外对于较小分子量的蛋白质，可能需要使用较高的电压以加快迁移速度，但要注意避免过热和条带压缩。

对于较大的蛋白质，使用较低的电压有助于减少条带压缩，但可能需要更长的电泳时间来确保充分分离。

最后，实验中可能需要根据具体的实验结果调整电压和凝胶浓度，以获得最佳的分离效果。

ECL 底物添加有技巧

提供足够的底物以产生稳定的化学发光信号。不过一定要严格按照制造商提供的说明书来配制 ECL 底物。很多同学在这步容易使用已经配置、使用过的 ECL 底物，可能会影响研究结果。

操作步骤：

配制 ECL 底物

目的和注意事项：按照说明书比例混合 A 和 B 组分，确保新鲜配制

膜的预处理

目的和注意事项：确保膜完全湿润，无气泡，使用适当的缓冲液

浸泡膜于 ECL 底物中

目的和注意事项：1 分钟，确保膜表面均匀覆盖，避免过长浸泡导致底物干燥或过度渗透

去除膜表面多余底物

目的和注意事项：轻轻摇动或用滤纸吸去，减少背景噪音

封闭袋内成像

目的和注意事项：根据信号强度调整曝光时间，进行成像

初始曝光时间可以从短曝光开始（例如 5 秒或 30 秒），根据成像结果调整，一般会选择过曝前的 3-5 张结果来进行分析、使用。

使用手套做实验！千万别触碰

使用一次性手套在实验室中是基本的无菌操作要求，尤其在细胞间，但是出了细胞间，很多同学就开始用「回收手套」，甚至不戴手套拿个管子瓶子，这也会对 WB 实验带来交叉污染。

可能影响：交叉污染

具体说明：皮肤油脂、死皮细胞或微生物可能污染样本，导致实验结果不可靠。

预防措施：在处理样本前后更换一次性手套，避免接触不同样本时的交叉污染。

可能影响：样品降解

具体说明：皮肤上的酶可能降解样本中的蛋白质，影响目标蛋白的检测。

预防措施：使用手套防止皮肤直接接触样本。

可能影响：膜损坏

具体说明：直接接触可能导致 PVDF 或硝酸纤维素膜的物理损伤。

预防措施：佩戴手套以减少直接接触，使用镊子或专用工具操作。

可能影响：试剂污染

具体说明：手套可以防止皮肤油脂污染试剂，保持试剂的纯净度。

预防措施：始终佩戴手套处理试剂。

在实验过程中，除了佩戴手套外，还应根据实验内容采取其他个人防护措施，如实验室大衣、护目镜等。

通过遵循这些操作指南和注意事项，可以最大限度地减少实验过程中的交叉污染，确保实验结果的准确性和可靠性。

注意仪器的日常维护

最后的最后，别忘记提醒实验室研究员定期校准电泳仪和转膜仪，检查电压和电流的稳定性。

清洁和维护设备，确保无漏电或短路；校准应记录电压、电流和时间，确保设备在规定范围内运行。

日常维护：每次使用仪器后进行，主要是清洁工作，确保仪器表面和操作区域的清洁。

月度检查：每月进行，重点在于检查仪器的所有控制元件和指示系统是否正常工作。

季度检查：每 3 个月进行一次，电泳仪和转膜仪分别进行性能校准和温度系统检查，以确保设备性能稳定。

半年检查：每 6 个月进行深度清洁和安全检查，包括清洁难以触及的部分和检查电线、连接器等，以确保设备安全。

通过精确控制这些关键细节，相信大家也可以显著提高 WB 实验的成功率和结果的可靠性。拒绝科研造假，用自己的双手做出漂亮条带!

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIxMjI0NzE3MA==&mid=2247512850&idx=1&sn=8021e8273d45523ab79288ed4b02f342

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