速学！！！WB实验保姆级教程——实验流程和常见问题

WB标准流程：样本制备→凝胶上样、电泳→转膜→封闭→抗体孵育→显影

一、蛋白提取

   吸弃细胞培养液，并用PBS溶液漂洗细胞2次，倒掉PBS后向每孔加入一定量的 RIPA裂解液+PMSF+蛋白酶/磷酸酶抑制剂（注：每种细胞不一样，加裂解液的量需要自己把控，最后上样10-20 μL为好；一般107个细胞中加入1 mL抽提试剂，5×106个细胞中加入0.5 mL抽提试剂），并于冰浴条件下裂解10 min。刮取收集蛋白至相应标号离心管中，超声（60HZ,超声3次，每次45s）并离心，4℃、12000 rpm 条件下离心15min ，取上清转移至新的离心管中。

注：裂解液常见组分与选择：

一定pH范围的缓冲体系，为蛋白提供了一个稳定环境，并增加蛋白溶解度。常用近似生理pH状态的Tris-HCl或HEPES缓冲体系，pH7.4。Tris-HCl（pKa=8.1）pH缓冲范围为7.0-9.2，其对温度较为敏感。HEPES（pKa=7.55）pH缓冲范围为6.5-8.5。

在适当盐离子浓度下，保持蛋白溶解状态。选择近似生理状态下的150 mM的NaCl，不会对破坏蛋白以及蛋白间相互作用产生影响。

螯合金属离子，以防止蛋白提取物过于黏稠，导致溶解度下降。另外，螯合剂亦可与某些酶发生相互作用，以抑制酶活性。

加入一定量的还原剂保护蛋白质上自由的巯基不被氧化，从而避免蛋白质的聚集或变性。常用β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），后者还原能力强于前者。β-巯基乙醇具有挥发性，加入缓冲液中以后较短时间内会被氧化，会对蛋白活性产生影响，其使用浓度为5-20 mM/L。而DTT具有更强的还原能力，且在氧化以后能够形成稳定的分子内二硫键，不会影响蛋白巯基，使用浓度相对偏低为0.5-1 mM/L。长期保存建议使用DTT，但DTT溶液不稳定，需要现配现用。

   去垢剂即表面活性剂，其通过分子结构特征，表面活性剂分子的疏水段插入膜的磷脂双分子层，而改变其通透性，最终破坏膜结构。因此，表面活性剂的强度直接决定了裂解细胞的强度。裂解液中所使用的表面活性剂主要可分为两大类：阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。常用表面活性剂如下：

十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子表面活性剂，具有很强的破坏力，基本可以使所有的蛋白溶解，并破坏其天然构象结构。SDS与蛋白分子以1.4:1的比例进行结合，可以有效的覆盖蛋白本身所带的电荷情况。SDS的临界胶束温度较高，在低温时即会发生沉淀，且在钾盐存在时，沉淀效果会更明显。另外溶液离子强度越强，会降低离子型去污剂的临界胶束浓度，使得这种蛋白溶解效果更强。

脱氧胆酸钠（NaDOC）：也是一种离子型表面活性剂，作用较SDS弱。

Triton X-100：是一种非离子型表面活性剂。可以破坏蛋白质与脂质间的相互作用，但并不使蛋白变性，也不破坏蛋白与蛋白间的连接，能够保留蛋白质的天然构象。其具有较低的临界胶束浓度，在64下，可观察到两相分离。

NP-40：非离子型表面活性剂，对核膜的破坏作用较弱，与蛋白结合力强，可确保蛋白的充分溶解和结构稳定，特别适用于膜蛋白非变形条件下的溶解。

Tween 20：温和非离子型表面活性剂，蛋白溶解能力较弱，也不会破坏蛋白结构，并不作为蛋白裂解液的常见成分。

二、蛋白定量与制样

1）标准品制备（标准曲线 R2应＞0.99）：取8个离心管编号1-8，按照试剂盒说明配置标准品，各取20 μL标准品加入到96孔板各孔中，并做3个复孔。

2）标准品和待测样品蛋白浓度检测：于上述96孔板样本孔中每孔加入20 μL 预先稀释好的待测样品（注：直接用蛋白原液检测样品蛋白浓度一方面损耗太多，另一方面有可能会超过标准品吸光度的最高值，因此这里蛋白原液稀释了多少倍后期记得计算回来），BCA试剂盒中的A和B工作液混匀后向标准品和待测样品中每孔加入200 μL反应液，轻轻拍打混匀后，于37℃恒温箱中避光孵育30 min。酶标仪测定570 nm~630nm 处吸光度，并计算蛋白浓度。（注：根据该种蛋白浓度计算方法得到的样品蛋白浓度，每个样品的上样体积不同，但不同样品的最终蛋白上样浓度是相同的。）

3） 蛋白变性处理：按照蛋白液（上清）：上样缓冲液=4:1的比例加入5×上样缓冲液（自配或商品化均可），100℃煮沸5 -10 min，随后将蛋白样品保存于-80℃冰箱。

注：

细胞也可以直接用胰酶消化下来，如果后续提取的蛋白只是用于WB实验，那么用含或不含EDTA的胰酶消化都可以，若要做流式不能用含EDTA的胰酶消化，具体的需要根据实验目的来确定。如果短期内不提蛋白，则可以先把细胞收集起来，用PBS洗两次，然后再12000rpm,离心5min,把PBS倒掉，用移液枪将残留的PBS吸净，之后放到-80度冰箱中保存。细胞提蛋白加入裂解液后可以直接加入磁珠，超声破碎，60Hz，30s,重复三次，细胞上样通常上10-30μg蛋白样品/孔。    

1. 根据蛋白定量结果，计算含相同蛋白量的样品体积。

2. 加入适量的上样缓冲液（通常为 5×），混合均匀。

3. 95 - 100°C 加热 5 - 10 分钟，使蛋白变性。

三、电泳

1. 制备分离胶和浓缩胶：根据蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶，先灌制分离胶，待凝固后灌制浓缩胶。

2. 上样：将处理好的样品加入上样孔中，同时加入蛋白分子量标准。

3. 电泳：恒压或恒流电泳，先 80 V 使样品在浓缩胶中浓缩成一条线，然后 120 V 直至溴酚蓝到达分离胶底部。

四、转膜

1. 准备转膜装置：依次放入海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜或 NC 膜、滤纸、海绵，注意各层之间不能有气泡。

2. 转膜：恒流 200 - 300 mA 转膜 1 - 2 小时（根据蛋白分子量和膜的类型调整）。

注：转膜的方法

WB实验中，转膜是将蛋白从凝胶转移到固相介质（如PVDF膜、NC膜）上的过程。以下是一些常见的转膜方法：

- 湿转：将“转膜三明治”完全浸没在Tris-甘氨酸转膜缓冲液中并施以电压，在电场的作用下，负电荷蛋白向正极移动，蛋白从凝胶转移到固相介质上，并与其相结合形成印迹。

- 半干转：三明治在转膜过程中并没有浸没在转膜液中，但在转膜之前用相应的电转液浸泡滤纸、膜和胶一定时间。

在选择转膜方法时，需要考虑以下因素： 

- 蛋白分子量：一般来说，湿转主要用于转渍大分子量蛋白质，而半干转主要用于转渍小分子量蛋白质。

- 实验条件和要求：湿转耗费转膜液较多，操作相对复杂，但适应广泛，对温度的控制较好，不容易出错。半干转转膜效率高，操作相对简单，但需要注意控制转膜条件以获得较好的转膜效果。

无论选择哪种转膜方法，在转膜过程中都需要注意以下几点：

- 保持转膜缓冲液的新鲜和正确的配方。

- 控制转膜时间和电压，避免过度转膜或转膜不足。

- 确保转膜三明治的组装正确，排除气泡。

- 在转膜后进行适当的封闭和清洗步骤，以减少非特异性结合。

五、封闭

1. 将膜放入封闭液（5%脱脂奶粉或 BSA 溶液）中，室温摇床上封闭 1 - 2 小时。

六、一抗孵育

1. 用封闭液稀释一抗，根据抗体说明书选择合适的稀释比例。

2. 将膜放入一抗溶液中，4°C 摇床孵育过夜或室温孵育 2 - 3 小时。

注：抗化孵育

c.一抗孵育结束后，加入TBSTBuffer洗涤4次，5min/次；

七、洗膜

1. TBST 洗膜 3 次，每次 10 - 15 分钟。

八、二抗孵育

1. 用封闭液稀释二抗，通常稀释比例为 1:5000 - 1:10000。

2. 室温摇床孵育 1 - 2 小时。

九、洗膜

1. TBST 洗膜 3 次，每次 10 - 15 分钟。

十、显色

1. 配制 ECL 发光液，将膜浸泡其中 1 - 2 分钟。

2. 取出膜，吸干多余发光液，放入化学发光成像仪中曝光成像。

1.非特异条带

◆ 抗体浓度过高：降低抗体浓度

◆ 封闭不足：提高封闭液浓度，如从 5% 提高到 7%；加封闭时间和/或温度；向封闭缓冲溶液中加入 0.05% 的 Tween 20；抗体稀释液采用相同的封闭液。

◆ SDS 使抗体和蛋白条带发生非特异性结合：转膜后洗涤印迹膜；在免疫检测过程中不要使用 SDS。

◆ 抗体质量：尝试使用不同的抗体

2. 条带弱或无条带

◆ 抗体问题，低活性或低浓度、低亲和力的一抗，错配的一抗和二抗：提高抗体浓度；抗体可能已经丧失活性，进行斑点杂交以确定其活性和最佳浓度；测试不同一抗和/或一抗-二抗组合

◆ 抗原抗体反应不足：增加凝胶中每个样品的总蛋白上样量；检查样品的完整性，确保蛋白未降解；抗原被封闭液封闭；尝试不同的封闭液 (比如，在检测磷酸化蛋白时避免使用牛奶)；优化封闭液浓度，建议使用浓度为 3–5% 的 BSA 或脱脂奶粉；化学发光底物性能不佳；增加底物孵育时间；准备少量工作液以确定底物是否已经丧失活性。暗室内，在底物工作液中加入少量 HPR 偶联物则应该会出现蓝光。如果没有的话，必定是底物或HRP 偶联物已丧失活性；确保底物试剂盒中的两个瓶子之间没有发生交叉污染。两种试剂之间如果发生交叉污染，则会引起试剂活性下降；叠氮化物是 HRP 的抑制剂，不要在二抗缓冲液中使用叠氮化物；印迹膜上抗体去除和再杂交；优化抗体去除条件；仅在必要时进行再杂交检测；避免对同一印迹膜进行多次重复再杂交

◆ 转膜不足：转膜时间过短，如果使用湿转法，则需增加转膜时间；转膜电场过弱，增加转膜电压或电流；转膜液未优化，在转膜液中加入 0.01-0.05%的 SDS；将转膜液中的甲醇浓度减少至 5% 或更少；凝胶选择不恰当，使用更低百分比的聚丙烯酰胺凝胶；在转膜后使用丽春红染液染膜，考马斯亮蓝染液染胶，确认转移效率，并在此基础上优化转膜条件；转过了；转膜时间过长，减少时间；转膜电场过强，降低转膜电压或电流；转膜液未优化，组装“三明治”之前，在转膜液中平衡凝胶 20 分钟以降低凝胶中 SDS 浓度，从而避免小分子量蛋白的过度转移；将转膜液中的甲醇浓度增加至 40%。

◆ 凝胶选择不恰当，使用更高百分比的丙烯酰胺凝胶

◆ 当目标蛋白分子量小于 10 KD 时使用 Tris/tricine 凝胶。使用 0.2 μm 的膜解决小蛋白转印过度的情况。

◆ 小蛋白会穿过大孔径的印迹膜，在 0.45μm 的膜后叠加 0.2 μm 的膜检测小蛋白转印过度情况

3.信号过饱和

◆ 中空条带：上样量过高，降低每个样品的总蛋白上样量；抗体过多，降低一抗和/或二抗浓度；化学发光底物过灵敏，更换使用灵敏度较低的化学发光底物.

◆ 条带过浓以至于条带粘连在一起：样品上样量过大，降低每个样品的总蛋白上样量；抗体过多，降低一抗和/或二抗浓度。

4.条带上有气泡

◆ “三明治”组装不恰当： 在组装 “三明治”的时候使用更多的转膜缓冲液；组装“三明治”的时候碾掉了凝胶和膜之间所有的气泡；在抗体孵育前用丽春红染液 染膜，以检查转膜质量。

5.转膜不均匀

◆ 印迹膜部分变干或水化不均匀：确保整张印迹膜均匀浸入转移缓冲液中并充分平衡；PVDF 膜在放入缓冲液之前需要用 100% 的甲醇预先浸湿平衡；硬件问题；检查湿转装置的线路连接；确保金属平板清洁，无物理损伤，即便是金属平板发生轻微弯曲也可以极；大地改变半干转印系统的电场强度。

6.背景过强

◆ 一抗和/或二抗浓度过高：稀释一抗和/或二抗浓度；封闭不足；提高封闭液浓度， 如 3–5% 的牛血清蛋白、酪蛋白、 脱脂牛奶；降低封闭时间和/或温度；向封闭液中加入 0.05% 的 Tween-20；抗体稀释液采用相同的封闭液（加入 0.05%的 Tween-20)；使用了错误的封闭液，一抗和/或二抗与封闭缓冲液中的蛋白相结合；尝试其他封闭液(白蛋白、酪蛋白、 脱脂牛奶等）。在使用亲和素-生物素；系统时不要使用牛奶来封闭印迹膜 — 牛奶含有生物素。

◆ 洗涤不足。

◆ 增加洗涤次数和缓冲液用量 (最少 5 × 5 分钟)。

◆ 如果洗涤液中未含有 0.1%的 Tween -20，请添加曝光◆ 时间过长。 

◆ 减少成像曝光时间。

◆ 印迹过程中印迹膜变干。

◆ 确保印迹膜保持湿润。

◆ 确保印迹膜一直覆盖有足够液体以防止其变干。

◆ 缓冲液重复利用导致污染。

◆ 使用新制缓冲液。

7.背景有污迹

◆ 部分印迹膜变干

◆ 确保印迹膜保持湿润

◆ 确保印迹膜一直覆盖有足够液体以防止其变干

◆ 洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足

◆ 增加洗涤缓冲液用量

◆ 避免过多印迹堆叠在一个孵育容器内

◆ 洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足

◆ 使用干净的或新的转移“三明治”

◆ 印迹膜污染

◆ 请勿用手直接接触印迹膜。一直配戴清洁手套或使用医用镊子

◆ 确保电泳设备、转移设备和孵育盘清洁，远离外部污染源

8. 背景有斑点

◆ 凝胶碎片粘附于印迹膜之上

◆ 将印迹膜表面残留的丙烯酰胺凝胶碎片移除成块的封闭剂粘附于印迹膜之上

◆ 确保封闭剂在使用前完全溶解

◆ 向封闭缓冲溶液中加入 0.1% 的 Tween-20

◆ 抗体聚合

◆ 使用 0.2 μm 的过滤器过滤抗体缓冲液

◆ 使用新鲜抗体向抗体缓冲溶液中加入 0.1% 的 Tween-20

◆ 缓冲液污染

◆ 使用新的缓冲液

◆ 使用 0.2 μm 的过滤器过滤缓冲液

◆ 在实验过程中，选为内参的持家蛋白表达水平发生变化

◆ 在实验条件下识别并验证选用的内参蛋白的一致性，即证实目前实验条件并不会改变该内参蛋白的表达水平

◆ 用染料给膜上的总蛋白染色，并以膜上检测到的总蛋白为内参

◆ 内参蛋白检测信号饱和

◆ 在实验过程中，选为内参的持家蛋白表达水平发生变化

◆ 减少上样量以消除信号饱和

◆ 稀释抗体浓度或减少孵育时间以避免检测信号饱和

◆ 选择另一个一致性表达的低丰度蛋白作为内参

◆ 用染料给膜上的总蛋白染色，并以膜上检测到的总蛋白为内参

1. 优化抗体选择：选择特异性高、亲和力强的抗体。可通过查阅文献、参考其他实验室的经验或者进行预实验来筛选合适的抗体。

2. 保证蛋白样品质量：提取蛋白时，严格操作以减少蛋白降解和杂质污染。确保蛋白的完整性和纯度。

3. 充分封闭：选择合适的封闭剂（如 5%脱脂奶粉或 BSA），并保证足够的封闭时间，以有效封闭膜上的非特异性结合位点。

4. 优化抗体孵育条件：控制抗体的浓度、孵育时间和温度，避免过高浓度或过长时间的孵育导致非特异性结合增加。

5. 严格洗膜：增加洗膜的次数和时间，使用适当的洗涤缓冲液，充分去除未结合的抗体和杂质。

6. 设立对照：设置阳性对照和阴性对照，有助于判断实验结果的特异性。

7. 优化电泳和转膜条件：确保蛋白在电泳过程中分离良好，转膜效率高且均匀，避免蛋白条带的扩散和重叠。

8. 避免交叉污染：在实验过程中，注意使用清洁的器具和试剂，防止交叉污染影响实验特异性。

1. 检测方法和仪器：如果实验室有化学发光检测仪器，辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗通常是较好的选择，因为它们能与化学发光底物产生强信号。若有荧光检测设备，且对多重检测有需求（同时检测多个目标蛋白），则可考虑荧光标记的二抗。

2. 灵敏度要求：如前所述，HRP 标记的二抗一般具有较高的灵敏度，适用于低丰度蛋白的检测。如果样品中目标蛋白含量较高，对灵敏度要求不那么苛刻，AP 或荧光标记的二抗也可能满足需求。

3. 背景干扰：某些实验体系中可能存在背景干扰问题。HRP 标记的二抗有时可能导致较高背景，此时可尝试 AP 或荧光标记的二抗，以降低背景。

4. 实验目的：如果需要同时检测多个蛋白，荧光标记的二抗可以通过不同的激发和发射波长来区分不同的目标蛋白。

5. 成本和便捷性：不同标记物的二抗价格可能不同，化学发光检测相对较为简便和常用，而荧光检测可能需要更复杂的仪器和操作。