为什么需要做ChIP？
ChIP（染色质免疫共沉淀，Chromatin Immunoprecipitation）技术是现代分子生物学研究，特别是表观遗传学的机制研究中一种非常重要的研究手段。其主要目的是研究目标蛋白（包括：修饰组蛋白，转录因子，辅因子及其他染色质蛋白）在染色质上的定位及丰度分析。
以组蛋白修饰为例，组蛋白H3的第四位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）主要定位在转录活跃基因的启动子CpG岛上，这提示我们H3K4me3跟转录激活相关；而组蛋白H3K27me3主要分布在转录抑制的基因上，这提示我们H3K27me3跟转录抑制相关。再以转录因子为例，如果我们知道某种转录因子定位在哪些基因的启动子上，我们就可以知道，这个转录因子调控哪些基因表达，而丰度的多少可以提示这种转录因子对不同基因的调控强度。
ChIP技术的原理
1）通过甲醛将染色质上的DNA和目的蛋白交联；
2）通过超声或酶解的方法将染色质片段化；
3）包含有目的蛋白的染色质片段通过抗体富集纯化；
4）通过加热解除DNA和目的蛋白的交联；
5）通过蛋白酶和RNA酶消化去除目的染色质的蛋白和RNA之后，将目的DNA纯化出来；
6）得到的DNA可以通过PCR检测目标区域的DNA是否被目的蛋白富集，或者通过DNA测序的方式检测目的蛋白在全基因组上的分布。
ChIP原理看似简单，但要想做好ChIP，得到高质量的数据却绝非易事，相信做过ChIP的同学都深有体会。那么问题来了，怎么才能做好这么难的ChIP呢？做好ChIP的关键步骤有哪些呢？下面就跟着小编的步伐一起来探索吧。
开始计划ChIP实验时要考虑的第一件事是起始材料。应该使用哪种样品类型，以及应该使用多少个细胞？通常情况下，每个ChIP实验需要使用数百万个细胞。对于一些培养细胞而言，获取数百万细胞并非难事，这种情况下建议使用足够量的细胞，操作起来比较简单，也能得到质量高的数据。但是对于某些样品类型，如原代细胞和干细胞，有时很难获得足够的细胞，而细胞数量恰好是这类样本获得良好ChIP和ChIP-Seq结果的主要障碍之一。绝大多数的ChIP方案都是需要先经过固定的。但也有一些方案不做固定，称为NativeChIP。在NativeChIP中，不希望DNA与感兴趣的蛋白质共价结合。NativeChIP方法通常仅适用于与DNA结合非常紧密的蛋白质，例如组蛋白。 在大多数ChIP实验中，需要进行固定以使DNA与相关蛋白质交联，并且不同细胞和组织类型需要不同的固定方案。需要考虑最重要因素是使用的固定剂类型和在停止反应之前的固定时间长度。其中甲醛是ChIP固定的常用标准，实验室通常使用浓度为1%含有甲醇的甲醛溶液，甲醇的加入会导致细胞渗透性增加，导致更多的甲醛进入细胞；如果不加入甲醇，甲醛不是很稳定并且容易聚合，会降低固定效率。1） 甲醛是一种非常活跃的小分子，它本身非常容易穿过细胞膜及核膜进入细胞核，并通过醛基将DNA碱基上的氨基/亚氨基与蛋白碱性氨基酸上的氨基/亚氨基交联。2） 甲醛的交联是可逆反应，可以通过加热的方式解除交联，从而方便后续的DNA分析。1） 甲醛交联本身需要一定的反应时间，对于小于5s的DNA与蛋白之间的动态相互作用是无法用甲醛交联捕获到的。2） 甲醛本身的分子量小，其作用距离是2埃，所以如果蛋白和DNA，或蛋白和蛋白之间相互作用距离大于2埃，甲醛是不能起作用的（有文献报道可以用分子长度更长的交联剂配合甲醛对蛋白和DNA进行交联，比如DTBP，DMA，DSG，DSP，EGS）。3） 甲醛交联需要作用于氨基或亚氨基，如果目的蛋白与DNA作用区域没有碱性氨基酸，两者也不能被甲醛所交联。另外，甲醛交联后对蛋白本身的表位会有一定影响，所以ChIP实验用到的抗体跟普通做IP的抗体也是有所不同的，需要用到专门的ChIP级抗体。根据多年来大家的摸索，一般的甲醛交联都选用1%的甲醛浓度，室温固定10-15分钟。时间太短的话，交联反应进行的不彻底，很多蛋白与DNA的结合不是很牢固；交联时间太长的话，会导致后续超声非常困难，而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构，进而导致ChIP结果不理想。这个固定条件适用于大多数样品类型，但在某些情况下可能需要优化；同时，选用甲醛交联还需要注意以下几点：1） 为了尽可能保存细胞原始状态下目的蛋白在染色质上的定位，所以在甲醛交联之前，细胞需要尽可能减少人为处理。如果条件允许的话，直接将甲醛加入培养基或将细胞培养基吸弃并换成含有1%甲醛的PBS交联会比胰酶消化细胞以后再交联更好一些。2） 甲醛交联反应结束之后，需要马上加入相对甲醛过量的甘氨酸（一般甘氨酸终浓度为125 mM）与甲醛反应，终止交联。3） 终止交联之后，样本需要经过PBS清洗（建议在PBS里加入0.1% NP-40，这样细胞在转移时不会粘在管壁或培养皿上）。清洗步骤后细胞沉淀可以直接用液氮速冻，然后置于-80摄氏度长期保存。组织的交联相比细胞交联要复杂一些。虽然甲醛可以很容易的透过细胞，但是大的组织块还是不太容易交联的很均一，所以大的组织块交联之前需要切成小块，但也并不是说组织块切的越小越好，因为组织块切的越小，细胞破坏的越严重。所以一般建议用两个刀片将组织块切成1-3 mm3大小。组织的交联时间一般可以延长到15 min，这样能保证组织的充分交联。染色质交联之后，需要通过超声或酶切的办法将染色质片段化。大部分实验室偏好于用前者，而很多做ChIP试剂盒的公司根据客户的需求（有些没有超声仪，有些把握不好超声条件），也大都推出了用广谱的核酸内切酶MNase（Micrococcal Nuclease）将染色质片段化的试剂盒。不管是用超声还是酶切，染色质片段化大小是ChIP实验的一个关键点，通常希望染色质片段在200-1,000 bp之间。通常情况下，固定了的细胞经悬浮后可直接进行超声处理，因此提取细胞核不是绝对必要的步骤；但在片段化染色质之前，通过分离细胞核来改善ChIP结果，也不失为一个好的选择。使用dounce研磨杵分离细胞核，并将核分离作为ChIP实验的标准步骤，这是因为我们发现分离细胞核后的ChIP实验能更容易得到高质量数据。（在细胞核被分离后，能够更轻松的获得可溶性染色质）大多数研究人员更喜欢用超声法来切割DNA，因为它高效且随机，但用超声法也有其局限性，如需要专门的超声设备，或需要根据样本优化超声条件。一些研究者没有超声设备，或者希望以一种温和的方式处理DNA，这种下情况酶切法（如MNase）不失为一个好的选择， MNase是一种优先切割AT富集序列区域的酶，它可以在一段时间内生成所需大小的染色质片段。但是让大多数科学家对酶切法产生顾虑的主要原因是其切割DNA具有碱基偏好性，高GC含量或紧密结构DNA区域消化不完全，易造成酶切位点附近的核苷酸发生突变。随着技术的发展，一些较新的染色质分析方法使用MNase与protein A/G偶联后再与抗体结合，使得酶切法能够应用于较低的细胞起始量（CUT&RUN技术）。没有一种超声处理条件能适合各种样本类型，最佳条件实际上是具有细胞或者组织特异性的，因此需要根据具体样品类型进行优化。超声时需要将细胞或细胞核重新悬浮在裂解缓冲液中，选择合适的超声条件去确保染色质被打断到200-1000bp的范围，通常情况下如果DNA片段太大，一方面会影响IP效率，更重要的是会影响ChIP的分辨率；如果DNA片段太小，虽然理论上能得到更高的分辨率，但也会影响后续的qPCR和建库。另外，除超声仪外，样品制备本身也有三个因素会对超声效果产生影响：1） 超声用的buffer，这其中尤其以SDS的影响最大，SDS浓度越高，DNA越容易被打断。同时盐离子和其他去垢剂浓度都会对超声产生一定影响，一般认为盐离子或去垢剂浓度越高，DNA越容易被打断，但也绝不是越高越好。2） 细胞密度，超声时的细胞密度越高，DNA越不容易被打断。所以建议细胞密度应小于107/ml裂解液。3） 细胞类型，不同细胞类型间，超声效果差异也很大。相对于常用的肿瘤细胞系，很多原代培养的细胞以及组织细胞的染色质超声破碎会更困难些。超声之后，一般需要先检测超声效果，确定DNA片段大小合适以后再做后续的IP实验。其具体步骤为，超声后的样品经高速离心，取部分上清解交联（解交联是一个温度介导的共价键打开的化学反应，温度越高解交联越快）。通常的解交联条件是65℃孵育4h，有些实室为了减少实验时间也会选择95℃孵育15min。但是95℃处理需要注意后续的缓慢退火过程，如退火过快，DNA就可能非正确复性，导致观察到的DNA大小产生偏差。解交联过程中可以加入适量的NaCl，对DNA起到保护作用。解交联之后的染色质，加入适量的RNase A，37℃处理1h后，再加入适量的Protease K处理1h。消化处理之后的DNA可以经过酚氯仿抽提或DNA纯化柱回收。得到合适片段大小的染色质后，下一步就该进行免疫沉淀了。在这一阶段，抗体无疑是非常关键的一个因素。有几种类型的抗体可用于ChIP实验，包括多克隆，单克隆和重组抗体。在ChIP的早期，许多研究人员倾向于使用多克隆抗体，因为多抗可以在不牺牲特异性的前提下通过识别多个表位放大信号。然而，现在大多数靶蛋白都有很多不同的抗体被验证过可用于ChIP实验，很明显多克隆，单克隆和重组抗体在ChIP分析中都可以表现良好。建议选择有明确ChIP验证的抗体，因为它能高特异性识别目的蛋白的立体表位，且在通过IP和洗涤步骤后仍然能够保持与目的蛋白的紧密结合。1） ChIP级别的抗体能够识别目的蛋白的立体表位。这跟做Western Blot的抗体是有区别的，因为WB的抗体识别的是蛋白的变性表位。2） ChIP级别的抗体还能识别甲醛交联后的立体表位。这跟做IP的抗体是有区别的，因为ChIP相对于IP需要甲醛交联的过程，甲醛会在DNA和蛋白质，以及蛋白和蛋白的氨基/亚氨基之间形成共价键，所以ChIP级的抗体还要识别甲醛交联后的目的蛋白。3） ChIP级的抗体跟目的蛋白有足够强的相互作用，能够耐受高盐，低盐及多种去垢剂（比如0.1% SDS，1%Triton X-100或NP-40）的清洗。如前所述，抗体是ChIP实验必不可少的因素，对于一些特殊的蛋白，可能找不到抗体或者没有可以用于ChIP实验的抗体，这是有可能会出现的。对于那种已知可用于其他应用的抗体，即使这个抗体已被证实可用于WB，但这并不一定意味着它可以用于ChIP。相比而言， IF和IHC是在固定条件下进行的，因此在这些实验中可用的抗体可能也可以用于ChIP，但情况并非总是如此；例如，ChIP中用于溶解和破碎染色质的缓冲液通常含有SDS，这是一种相对苛刻的阴离子洗涤剂，高浓度的SDS会干扰抗体和蛋白质的结合，因此即使这个抗体从技术上分析能够在固定的条件下结合目的蛋白，但也有可能最终因为结合不够紧密导致整个ChIP失败。如果目标蛋白没有商业化的抗体可选，一种方式是定制抗体，之后进行ChIP验证。这种方式的优点是检测到的是内源性的蛋白，结果反映的一定是体内真实的蛋白和DNA相互作用，但定制抗体成本较高，并且ChIP验证过程失败率高达75%。另一种方式是给目标蛋白加标签，通过标签抗体检测目标蛋白。通过质粒构建加到目标蛋白C端，转染进入细胞之后通过特异性AM-tag抗体进行ChIP。 IP的另外一个关键因素是buffer，这包括binding buffer（超声用buffer）和wash buffer。因为组蛋白与DNA的结合比较牢固，所以相对来说组蛋白修饰的ChIP更容易做，对buffer的要求也不是太严格。但是对于很多转录因子来说，因为本身跟DNA的结合不是特别紧密（很多都是动态结合），在同一染色质区域，只有很少部分细胞可以捕获到目的蛋白和DNA的结合，所以通过合适的buffer将目的蛋白结合的DNA与背景DNA区分并分离出来就显得很关键了。一般来说，选用的Buffer越剧烈，背景DNA去除的就会越干净，但同样的，目的DNA也会被更多的清洗掉。反之，选用的buffer越温和，目的DNA得到的就会越多，但同样的，背景DNA也就残留的越多。对于去垢剂来说，离子型去垢剂（如SDS，SDC）比非离子型去垢剂剧烈得多；对于盐来说，剧烈程度LiCl＞NaCl＞KCl。总之，去垢剂、盐离子的种类以及浓度都会对ChIP效果产生很大影响，很多实验室或公司在这方面都有自己独到的buffer配方。最后，除了以上关键因素之外，为了降低背景，很多实验室会在两个地方做优化：1） 在超声破碎之前，首先破碎胞浆，通过离心将胞浆胞核分离，去除胞浆蛋白，降低胞浆蛋白干扰。2） 用超声后的染色质与protein A/G beads预孵育，等去除beads之后再加入鲑精DNA预封闭过的protein A/G beads和目的蛋白抗体进行孵育。（根据笔者个人经验，这两点优化也许能够降低背景，但并不是成功与否的关键。当然对于与染色质结合不强的蛋白的ChIP实验或少量细胞的ChIP实验，降低背景就比较必要了。
