在过去的几十年中，肽连接化学得到了飞速发展，为制备无法通过表达或其他生物工程方法获得的蛋白质提供了新的机会，例如具有位点特异性翻译后修饰的蛋白质、具有非天然氨基酸的蛋白质和镜像蛋白质。化学蛋白质合成使人们能够进一步探索传统重组技术以外的生命科学和医学领域。蛋白质化学合成成功的关键在于化学选择性连接方法的可用性，这些方法可以通过形成天然肽键有效地结合未受保护的肽片段。Kent及其同事开发的C端硫酯和N端半胱氨酸的天然化学连接(NCL)无疑是肽连接化学的一次变革性突破。
在过去的二十年里，随着制备C端硫酯（或替代物）和硫醇衍生氨基酸的有效策略的发展，NCL已广泛应用于各种蛋白质的化学合成。受NCL的启发，人们还开发了许多其他具有不同机制和末端功能的化学选择性连接作为获取蛋白质的手段，例如依赖于C末端带有水杨醛（SAL）酯和N末端带有丝氨酸/苏氨酸的肽的丝氨酸/苏氨酸连接（STL）、携带C末端酮酸和N末端羟胺的肽之间的α-酮酸-羟胺（KAHA）连接、利用C末端带有硒酯和N末端带有硒胱氨酸的肽的无添加剂二硒化物-硒酯连接（DSL）以及连接带有C末端SAL酯和N末端半胱氨酸/青霉胺的肽的半胱氨酸/青霉胺连接（CPL）。这些方法作为NCL的重要补充，为蛋白质的化学制备提供了更多的连接断开位点和“正交”合成策略。
然而，这些连接方法也有其自身的局限性。例如，肽硫酯很难用Fmoc化学合成，而NCL几乎无法处理在C端带有空间要求高的氨基酸（尤其是脯氨酸和缬氨酸）的肽硫酯，因为Nα-羰基的立体位阻作用和使n→π*相互作用失活。肽SAL酯（替代物）的合成工艺复杂，一直限制着STL和CPL的应用。为了解决这些缺点，人们开发了许多有效的策略，其中最广泛应用的是肽酰肼化学。通过硝酸盐氧化和硫解方法，肽酰肼可以很容易地转化为相应的肽硫酯，并顺利地与Cys-肽连接。
到目前为止，已经开发了多种制备肽SAL酯的方法（图1a），以推广STL和CPL的应用。例如，N-肽基苯并咪唑啉酮（Nbz）通过水杨醛二甲基缩醛进行树脂上酚解，水杨醛二甲基缩醛与C端为甘氨酸/脯氨酸或假脯氨酸的全保护肽直接偶联，将全保护的“n”肽与带有氨基脲保护的水杨醛（SALSCA）的“1”单元偶联实现的‘n+1’策略，与Boc-SPPS兼容的氨甲基（AM）树脂上的基于臭氧分解/缩氨基脲的策略，以及依赖于O-到-O酰基转移的2-（二氯甲基）苯酚介导的策略。最近，何志强等人通过基于肽酰肼的氧化和酚解策略成功制备了肽3-(1,3-二硫代-2-基)-4-羟基苯甲酸[SAL(-COOH)PDT]酯，该酯可活化并用于后续的肽连接反应。利用这些方法，人们还开发了一些增强连接方法来解决膜结合蛋白或镜像蛋白的合成问题，例如骨架安装的分裂内含肽辅助连接法(BISIAL)、先前的二硫键介导的STL和三氟乙酸(TFA)中肽结合介导的增强NCL。
TSAL 酯诱导的化学选择性肽连接（图源自Advanced Science ）
虽然这些进展大大扩展了相应连接方法的适用范围，但每种方法中同时存在的许多问题尚未得到有效解决，例如使用危险的爆炸性和毒性试剂（例如AgNO3、有气味的1,3-丙二硫醇(PDT)等）。此外，当肽SAL与C端Lys/Glu/Asp酯化时，由于在标准连接条件下不稳定，无法进行STL和CPL。因此，开发能够容忍更多未受保护的功能化基团并依赖于易得反应物的新型、强大的连接方法，对于合成蛋白质化学来说仍然迫切需要。
在本研究中，作者描述了一种有效且易于操作的连接反应，该反应在C端带有2-巯基苯甲醛（硫醇水杨醛，TSAL）酯的肽和N端带有半胱氨酸/青霉胺的肽之间进行，即使在空间位阻连接处也能顺利生成天然肽键（图1b）。肽TSAL酯可以通过一种操作简单的策略从肽酰肼中轻松制备，并且与C端未受保护的Lys/Glu残基足够稳定（图1a）。值得注意的是，肽酰肼可以很容易地通过合成或重组获得，这使得利用TSAL酯诱导的连接实现蛋白质的全合成和半合成成为可能。此外，肽TSAL酯前体的高稳定性使得多种连接策略联合使用可以实现聚合蛋白合成（图1c，d）。通过STL和TSAL酯诱导连接策略的联合策略，实现了泛素和Hyal-3的高效合成、UFM1的C-N合成以及MtbCM的化学合成，证明了该新方法的有效性和实用性。
参考消息：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202408538
