在本系列的前两篇文章《诱导多能干细胞衍生间充质干细胞疗法的研究进展及创新策略（一）/（二）》中我们着重探讨了由iPSC获得iPSC-MSC的方法学研究进展、这类衍生细胞产品在不同疾病模型中的应用以及临床级iMSC衍生细胞治疗产品的研究进展。本篇作为这一系列讨论的最终章，将重点论述这类iPSC-MSC在产品商业化开发过程中的策略，包括开发功能增强型产品及衍生细胞及生物制品的主体研究思路及注意事项，在开发先进治疗药物（ATMP）过程中需重点关注的问题进行探讨。不论是将MSC还是iMSC细胞开发成一款先进治疗产品，其成药过程的核心问题在于如何开展药物制造工艺的研发以及如何实现干细胞药物良好的质量控制。制药企业需要基于质量源于设计（Quality by Design,
QbD）的理念，以合理的科学和质量风险管理为依据，起始于预定的质量目标，注重对MSC/iMSC产品和其工艺的理解和对生产工艺过程控制系统的研发方法（ICHQ8）。企业研发人员还需要基于风险评估，识别直接影响产品安全性和有效性的关键质量属性（Critical Quality
Attribute，CQA），找到关键工艺参数（Critical Process
Parameter，CPP），开发出设计空间（design space）来量化参数的可变性对质量属性的影响，随后开发控制策略（control strategy）以维持工艺参数从而保证产品质量，并且放大规模进行工艺验证。 MSC/iMSC产品开发过程中的困难点包括：如何建立符合GMP标准的实验方案，影响原料选择的因素，细胞扩增到制剂配方，建立质量控制（QC）参数，以及符合GMP要求的质量标准[1]。MSC产品的关键质量参数（CQA）包括对MSC产品的鉴定、纯度、生物学效力和安全性等四大维度。此外关于iMSCs和组织来源MSCs在再生、分化和免疫调节能力的比较仍需要更多的研究工作。在开发iMSC产品时，还需要额外关注产品的异质性，可以进一步通过单细胞转录组测序方法分析iMSC细胞不同亚群情况。另外因为工艺上游的iPSC种子细胞具有潜在的成瘤风险，因此需要开发稳定且高灵敏度的iPSC残留及非预期分化细胞残留的检测方法，来证明终产品不具有成瘤性[2]。相比于原代来源的MSCs，iMSC产品会经过较长时间的体外培养和传代过程，需通过全基因组测序，关注iMSC产品的遗传学安全性。通过规范标准化质量控制程序，建立制造标准，确保不同来源的间充质干细胞或不同分化路径的iMSC细胞具有一致的质量和效力，从而提高产品的一致性、可靠性和安全性，促进其向GMP级临床应用产品的转化。目前iPSC及其衍生产品的商业化用途的主要领域包括细胞治疗、疾病建模、药物开发及发现、个性化医疗和毒理学筛查等。结合该类产品的研发和市场表现，我们发现iMSC产品除了具备制备过程简单、细胞来源一致、均一性好、适合大规模生产的优点外，还更方便从种子细胞进行基因改造，从而打造iPSC衍生细胞的二代产品。已有研究报道，特异性编辑iPSC细胞形成的CAR-iPSC可作为种子细胞用于稳定的CAR-NK细胞生产[3]。CRISPR/Cas9基因编辑技术也可广泛用于MSCs的基因改造[4]。对MSC细胞进行基因修饰，可使其脱离外源因子刺激，提高其治疗潜力。多种基因的持续性表达增强能够显著提高MSC的疗效。在不同适应症中，不同基因发挥的功能存在显著差异。MSC的治疗效果高度依赖于体内迁移与归巢能力，迁移能力与MSC上表达的趋化因子受体和组织中的趋化因子相关。其中一个功能增强的基因改造方向为过表达MSC上的特定趋化因子受体（如CCR1和CXCR2）。另外有报道包括IL-4、IL-10、TGF-β1、GATA-4和CXCR4基因都有提高干细胞活率，增强疗效的作用[5]。BM-MSCs过表达VEGF会促进血管生成并改善脑梗死，提高细胞活率并增强旁分泌效应[6]。为实现低氧预处理效果，将HIF-1α转染至BM-MSCs可模拟其在低氧暴露下更强的治疗效果[7]。然而，将基因改造操作应用于原代间充质干细胞，需要经过长期培养与筛选，难以避免会造成细胞的复制性衰老，降低MSC的治疗效果，并不适用于实际临床应用与细胞治疗产品的开发。因此，针对特定适应症选择适合的基因，对作为分化起始的种子iPSC进行有功能的基因编辑后，再进一步诱导分化形成iMSC，能够帮助研究者获得特定基因稳定改造的且异质性低的iMSC细胞。这一操作有助于开发功能增强型的iPSC衍生二代产品，然而对某种基因的持续性激活或敲减，仍需经过长期复杂的前期论证，以确定该产品的安全性。iMSC衍生产物-外泌体（iMSC-EVs）作为先进疗法可能性间充质干细胞释放的外泌体（MSC-Exos）在免疫调节和组织再生方面具有广泛的应用前景。外泌体主要功能可分为组织修复和抗纤维化，具有多种类型适应症（如膝骨关节炎、脊髓损伤、皮肤损伤、肝肾肺组织纤维化、神经相关疾病等）的治疗潜力[8]。一系列临床前研究结果也证明，与MSC-EVs的生物学功能相类似，iMSC来源的EVs对多种适应症也有很好的治疗效果[9]。目前EVs作为药物开发的核心难点主要体现在两方面：外泌体来源细胞的异质性造成的批间差和大规模生产及纯化的可操作性。而iMSCs来源于一株均一的iPSC种子，可以通过工艺前期筛选合适的iPSC细胞株，通过稳定的分化工艺获得同质性很高的iMSC，以这些细胞为来源制备外泌体，直接克服了原代细胞的异质性，保证了产品较小的批间差。另外通过恰当的制备工艺获得的iMSC产品，能够保证细胞持续且强的体外扩增能力，从而通过直接放大上游种子细胞规模而扩大EVs的生产规模。除此以外，从提高EVs的浓度、靶向性和负载功能分子等方面，也能够提高iMSC-EVs的药效。可以通过3D工艺在反应器规模培养灌流或批培养iMSC，加快细胞生长速率从而加快外泌体的分泌；或者使用小分子药物预处理iMSC，调控并增加外泌体的分泌量；也可以通过基因改造iMSCs，使特异性靶点分子与外泌体表面的蛋白融合表达，增强外泌体对功能分子的负载[10]。对于外泌体产品，需要严格参考国际标准（ISO 24603）中对外泌体相关的研究规范，从而规范外泌体生产的上游步骤。近期在中国也发布了两项团体标准，《人多能干细胞来源的小细胞外囊泡》（T/CRHA 002-2021）及《人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡》（T/CRHA 001-2021），在产品开发中应关注外泌体关键质量属性包括：1、用于生产小细胞外囊泡的人间充质干细胞的关键质量属性应符合规定；2、小细胞外囊泡的形态、粒径、标志蛋白、纯度、免疫调节能力、微生物安全性等关键质量参数应符合标准；3、详细的过程控制：详细记录小细胞外囊泡的分离方法。在今年10月31日国家药监局发布的《2024年第二次医疗器械产品分类界定结果汇总》中，明确了针对干细胞外泌体为建议不作为医疗器械管理的产品。而外泌体究竟能够以何种“身份”投入市场，用于患者，还需要对外泌体基础科学研究的不断深入，对外泌体生产规范和质量标准等法规的逐步完善，以iMSC来源的EVs会逐渐展现出潜在的优势，逐渐实现向GMP级产品的转化与应用。如本系列文章中汇总的，iPSC-MSC具有优越的生物学性状及很好的治疗效果，然而我们必须认识到，影响iMSC成药的核心决定性因素与MSC是类似的。除了药学，还包括临床疗效。MSC输注后患者临床疗效差异较大，关键因素在于MSC的体内治疗机制十分复杂，且目前尚不明确。虽然大量的体外研究结果公认MSC具有多系分化潜能，能发挥免疫调节与抑炎功能，通过旁分泌作用产生细胞因子、外泌体和外囊泡等物质，或者通过影响线粒体等细胞器转移发挥抗纤维化、损伤修复、促进组织再生等功能[11]，然而到了人体内的变化并不明确。在临床上，研发人员仍需要建立疗效与生物学活性检测指标间的相关性。如果能够找到关键的效应细胞和关键作用分子，检测与作用机制相关的通路，开发出与产品表征和临床结局之间关联的分析方法，将显著提高MSC的成药概率。在现阶段，我国已出台《人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则》（试行），对产品的质量标准及临床申报标准进行了规定，因此在iPSC及其衍生细胞制品真正应用于临床之前，需要建立可靠、系统性、贯穿整个产品生产全过程的安全性评估体系和放行，包括对终产品多能干细胞残留检测、克隆形成实验、裸鼠成瘤实验、动物长期致瘤性实验等，用于严格把控生产工艺与产品质量。在检测方法的选择方面，检测费用、实验周期、数据分析工作量以及结果解析的复杂程度都应进行综合考虑并结合实践改进与完善。
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