文章来源于验小六的晚课时间，作者Dr. Wu
前言
PCR（聚合酶链式反应）作为分子生物学中的一项核心技术，自其诞生以来，极大地推动了生命科学和医学诊断领域的发展。而PCR熔解曲线分析技术（Melting Curve Analysis, MCA）作为PCR技术的一个重要分支，以其独特的优势在分子诊断领域展现出广泛的应用前景。本文将深入探讨PCR熔解曲线分析技术的原理、在临床中的应用，并与实时荧光PCR（qPCR）技术进行对比分析，以期为读者提供全面的了解。
01
技术原理：精准锁定，温度揭示真相
PCR熔解曲线分析方法是一种PCR技术衍生的检测方法，它整合了多重PCR、荧光PCR以及熔解曲线分析三大技术。为了便于理解PCR熔解曲线分析技术，从PCR技术、熔解曲线分析技术原理进行分享，揭示技术真相。
1.1
PCR技术原理
PCR是一种在体外模拟DNA复制过程的技术，通过设计特定的引物，在DNA聚合酶的作用下，以目标DNA为模板，进行反复的变性、退火和延伸三个步骤，从而实现DNA片段的指数级扩增。
1.2
熔解曲线分析技术原理
PCR熔解曲线分析技术是在PCR反应完成后，通过逐渐增加温度并监测每一步的荧光信号来检测和分析扩增产物的方法。其基本原理在于，不同的DNA片段由于其碱基组成和长度的差异，具有不同的熔解温度（Tm）。在PCR反应结束后，通过设定特定的热循环程序，对PCR产物进行逐渐加热，同时监测体系中的荧光信号变化。随着温度的升高，双链DNA逐渐解离成单链，结合在双链DNA上的核酸嵌入式染料（如SYBR Green I）因失去结合位点而重新游离在体系中，导致体系荧光信号的衰减。当DNA双链结构解离一半时对应的温度即为该DNA片段的熔解温度（Tm）。
目前，主要有荧光染料【原理见图2a】 / 荧光探针熔解曲线技术【原理见图2b】两大类。
图2a 图2b
目前临床应用最为广泛的是基于荧光探针熔解曲线技术方法，该技术是一种基于荧光PCR探针技术的检测方法，它整合了多重PCR、多色荧光探针以及熔解曲线分析三大技术，该技术的基本原理是，在PCR反应体系中加入一个与靶序列特异性结合的荧光探针，该探针通常包含荧光基团和淬灭基团，在PCR扩增结束后，通过逐渐加热反应体系，监测荧光信号随温度的变化，绘制出熔解曲线。熔解曲线的熔解温度（Tm值）反映了靶序列的特异性。
1.3
代表性熔解曲线技术
目前，国内外针对熔解分析技术衍生出多种技术实现路径，以下是目前具有代表性的技术路径。
02
PCR熔解曲线分析技术在临床中的应用
PCR熔解曲线分析技术在临床中的应用非常广泛，主要体现在以下几个方面：
2.1
病原体检测与鉴定
· 该技术可用于病原体的快速检测和鉴定。
· 通过设计特异性引物扩增目标病原体的DNA序列，并结合熔解曲线分析，可以区分不同种类的病原体，甚至在同一反应中同时检测多种病原体。这对于感染性疾病的诊断和治疗方案的制定具有重要价值。
2.2
基因突变检测
· PCR熔解曲线分析技术能够用于检测基因的单核苷酸多态性（SNP）和突变。
· 通过监测DNA在加热过程中熔解的温度和熔解曲线的变化，可以精确识别基因序列中的微小变化，如点突变、插入或缺失等。这对于遗传病诊断、肿瘤标志物筛查以及药物敏感性预测等方面具有重要意义。
2.3
耐药基因检测
· 在耐药基因检测方面，PCR熔解曲线分析技术同样表现出色。例如，在耐药结核病的诊断中，该技术可以快速检测结核分枝杆菌中的耐药基因突变，为临床提供及时、准确的耐药信息，指导医生制定合理的治疗方案。
2.4
食品安全与质量控制
· 在食品工业中，PCR熔解曲线技术可用于检测食品中的过敏原、转基因成分及有害微生物，确保食品安全。
03
PCR熔解曲线分析技术应用案例及结果解析
3.1
国家致病菌识别网呼吸道症候群监测项目应用案例
预期用途及设计
国家致病菌识别网呼吸道症候群监测项目是一个由国家卫生健康委统一开展的全国细菌性传染病实验室监测任务之一，纳全生物针对监测方案开发了针对霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、沙门菌（salmonella）、志贺菌（Shigella）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、结肠弯曲菌（Campylobacter coli）、小肠结肠耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）、艰难梭菌（Clostridioides difficile）、阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas Shigelloides）、河弧菌（Vibrio fluvialis）这12种腹泻症候群病原体鉴别诊断试剂盒。
产品的具体设计方案如下表所示，即通过荧光通道和熔解曲线Tm值2个维度的分析，即可实现单个反应管完成12种呼吸道病原菌的鉴别检测。
技术特点
· 简单：加⼀次样，即可完成1个症候群检测
· 精准：独有超多重荧光PCR技术，灵敏度⾼，特异性好
· 智能：⾃动辅助判读软件，检测结果⼀键判读，检测数据⼀键导出
适配仪器
适配目前主流具有熔解曲线分析功能的荧光PCR仪器，包括ABI Q5，BioRad CFX96、宏石SLNA96S以及雅睿MA6000等，具体检测结果如下图所示。
性能评价
试剂盒进行了充分的分析性能研究，在特异性、灵敏度上均表现优异，符合足预期性能要求，下图展示的是部分性能数据。
自动判读结果
PCR熔解曲线系列产品均自带自动判断分析软件NatureView，qPCR仪导出原始数据 → 数据导入NatrueView → 即可自动输出判读结果。
3.2
基因突变检测项目应用案例
案例背景
K-ras基因是肿瘤中常见的突变基因之一，其突变与多种癌症的预后和治疗疗效密切相关。为了有效预测癌症患者对靶向治疗的反应，研究人员开发了基于PCR熔解曲线分析的K-ras基因突变检测方法。
应用方法
针对K-ras基因设计特异性探针，与目标基因的突变位点结合，通过PCR扩增目标基因片段，并在扩增过程中加入探针，利用熔解曲线分析技术，观察探针与目标基因结合后的熔解曲线变化，不同的基因突变会导致探针与目标基因的结合稳定性发生变化，从而改变熔解曲线的形状或Tm值，通过检测这些变化可以识别出K-ras基因的特定突变类型（结果见下图）。
04
与实时荧光PCR技术比较分析
优势
1. 高特异性
· PCR熔解曲线分析技术通过熔解曲线的特征（如Tm值、峰形等）来判断PCR产物的特异性，能够有效区分目标DNA片段和非特异性扩增产物。
· 而qPCR技术虽然也能通过荧光信号的变化来监测扩增过程，但在特异性检测方面相对较弱，需要依赖其他方法（如熔解曲线分析）进行辅助判断。
2. 快速简便
· PCR熔解曲线分析技术在操作简便性上具有一定优势。该技术通常是在PCR扩增结束后，通过简单的热循环和荧光信号监测即可完成。
· 与qPCR技术相比，它无需在PCR过程中实时监测荧光信号，也无需额外的荧光探针或复杂设备。因此，实验步骤相对简化，操作更加便捷。
3. 节省成本
· 从成本角度来看，PCR熔解曲线分析技术同样具有优势。由于它不需要荧光探针或复杂设备，因此实验成本相对较低。此外，该技术通常可以与常规的PCR仪器兼容，无需额外投资购买昂贵的荧光检测设备。相比之下，qPCR技术需要特定的荧光检测设备和昂贵的荧光探针，增加了实验成本。
· 具体而言，PCR熔解曲线分析技术所使用的荧光染料（如SYBR Green I）成本较低，且可以重复利用。而qPCR技术中的荧光探针则是一次性使用的，成本较高。此外，qPCR技术还需要专门的荧光检测软件来分析数据，这也增加了额外的成本。
劣势
1. 定量能力较弱
· qPCR技术的最大优势之一在于其强大的定量能力。通过标准曲线和CT值，可以准确计算待测样品中目标DNA的拷贝数，实现精确的定量分析。
· 而PCR熔解曲线分析技术虽然可以通过熔解峰的高度来粗略估计扩增产物的量，但其定量能力相对较弱，难以满足需要精确定量分析的实验需求。
2. 分析线性有限
· qPCR技术在检测样本标志物浓度动态范围的线性指标上会优于PCR熔解曲线分析技术，qPCR能够在广泛的浓度范围内保持线性关系，从而提供更准确、更广泛线性结果。
· 相比之下，PCR熔解曲线分析技术的线性指标上较为有限，可能无法在检测低浓度和在高浓度的模板核酸范围内保持良好的线性关系。
优劣势融合
1. 应用场景互补
在实际应用中，PCR熔解曲线分析技术和qPCR技术各有其适用的场景。
· 对于需要快速、简便地进行特异性检测或基因突变筛查的实验，PCR熔解曲线分析技术是一个理想的选择。它能够在不增加太多成本和操作复杂性的情况下，提供可靠的特异性检测结果。
· 而对于需要精确定量分析、高灵敏度检测或广泛动态范围分析的实验，qPCR技术则更具优势。
2. 技术互补
值得注意的是，PCR熔解曲线分析技术和qPCR技术并不是相互排斥的，而是可以相互补充和结合的。
· 例如，在某些实验中，可以先通过qPCR技术进行精确的定量分析，再通过PCR熔解曲线分析技术验证扩增产物的特异性。这种结合使用的方法可以充分利用两种技术的优势，提高实验的准确性和可靠性。
05
展望
PCR熔解曲线分析技术以其独特的原理和广泛的应用前景，在分子生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。它通过监测PCR产物的熔解温度来评估其特异性和引物设计的有效性，为疾病的早期诊断、基因突变的筛查以及耐药基因的检测提供了有力支持。尽管在定量能力和线性指标方面与qPCR技术相比存在一定劣势，但PCR熔解曲线分析技术在操作简便性、成本效益以及特定应用场景下的优势使其成为一种不可或缺的分子诊断技术手段。
未来，随着技术的不断进步和应用领域的不断拓展，PCR熔解曲线分析技术有望在更多领域展现出其独特的价值。
参考文献：
【1】Kirk M Ririe, et al., Anal Biochem.1997, 245:154-160
【2】Irina V, Botezatu et al., Anal Biochem. 2015 , 491:75-83
【3】Huang Q, et al. PLoS One. 2011, 6(4): e19206
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文章来源：中国基金报、迈瑞医疗
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