AM丨智能噬菌体滴眼液用于临床多药耐药眼表感染

全世界有超过2.5亿人受到眼科疾病的影响。细菌性角膜炎（BK）是最常见的眼科疾病之一，也是导致失明的第二大原因。BK常发生于角膜外伤后，其严重程度与感染菌株的类型和毒力以及宿主免疫反应密切相关。铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）对各种抗生素具有天然耐药性，是最常见且最危险的BK诱发因素之一。近年来，铜绿假单胞菌感染介导的BK发病率显著增加，主要是因为铜绿假单胞菌在晶状体和角膜之间建立了一个生态位，促进细菌生物膜过度生长并在24-48小时内破坏整个角膜，导致视力预后不良。

该感染进展迅速，导致角膜化脓、穿孔、瘢痕形成、疼痛、畏光、视力丧失，甚至失明。世界卫生组织（WHO）发布发首份抗生素耐药性重点病原体清单中，铜绿假单胞菌在抗生素耐药性病原体名单上排名第二。值得注意的是，排名前三的病原体全是革兰氏阴性菌（鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科），强调了常规抗生素在应对这些细菌方面面临的挑战。革兰氏阴性菌的复杂双层膜阻碍了抗生素的有效性。抗微生物药物耐药性（AMR）已成为全球公共卫生的十大威胁之一。美国疾病控制与预防中心（CDC）认为，过去十年中，耐多药铜绿假单胞菌（MDR-PA）每年至少造成32600例感染和7.67亿美元的医疗费用。

由于BK发作迅速，在明确诊断之前，局部施用广谱抗生素是一线临床治疗方法。由于其表面积小，直接给药眼药水是BK治疗最常用的方法。然而，传统的眼药水通常由非特异性广谱抗生素组成。眼睛的独特结构及其生理特性，如血眼屏障、频繁眨眼和流泪，导致眼药水效果差（药物生物利用度<5%），需要每小时给药且延长治疗时间，多次给药可能产生微生物污染并导致副作用。由于血-眼屏障的存在，如果通过全身静脉给药，则需要过量给药。

此外，抗生素的频繁甚至过度使用，导致越来越多的细菌产生多药耐药性，甚至进化为“超级细菌”，加剧了BK的威胁。铜绿假单胞菌不仅通过其脂质双层膜和夹心结构抵抗各种抗生素，还容易将细胞嵌入细胞外聚合物物质（EPS）中形成生物膜，将抗生素耐药性提高10到1000倍。生物膜是由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成的自产聚合物基质，能够充当复杂的3D保护屏障。当MDR-PA形成致密的生物膜时，具有很强的毒性，并产生蛋白水解酶，迅速溶解和坏死角膜组织，导致早期角膜瘢痕形成。角膜瘢痕唯一可用的治疗方法是角膜移植，但往往缺乏合适的角膜供体。因此，开发治疗MDR-PA感染引起的BK的替代疗法至关重要。

图1 智能ACR-DMT臂噬菌体滴眼液治疗临床MDR-PA BK示意图（摘自Advanced Materials ）

近年来，基因组编辑或递送方法（如病毒载体、微针或水凝胶）在治疗眼科疾病方面取得了许多进展。但存在不适、视力受损或细胞毒性等明显副作用，缺乏在视力和视神经方面的系统评估。光动力疗法（PDT）因其对抗耐多药细菌和生物膜感染的有效性而受到广泛关注。PDT利用光敏剂（PS）在光照射下产生有毒活性氧（ROS），引起脂质、核酸或蛋白质的氧化损伤，并诱导不可逆的细菌死亡，可能同时产生免疫反应，且基本无耐药性，全身毒性低、副作用最小。

最近，已经开发出几种用于治疗BK的PS，但有三个关键因素限制了大多数PSs在根除生物膜方面的应用：1）PSs的生物膜穿透能力低。近期报道的PS和抗生素主要针对革兰氏阳性菌，但革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌的外排泵系统更为活跃、结构更复杂。铜绿假单胞菌的高外膜通透性和外排泵表达导致了高耐药性的发生，同时阻止了抗生素在靶位点的积累。此外，由于其复杂的三维网络结构和负电性，大多数PSs无法有效地渗透革兰氏阴性铜绿假单胞菌的EPS或脂质双层膜，以根除其生物膜并消除其中的细菌。

2）生物膜中缺氧微环境的固有特性。大多数PS通过能量交换过程（II型机制，即O2依赖）生成1O2。虽然O2补充技术、高压氧疗法和缺氧反应性PS已被用于增强PDT的疗效，但可能会引起氧中毒和高毒性癫痫发作等负面结果。上述过程产生的1O2细胞毒性较低，作用范围有限，导致抗生物膜效果较差，无法根治感染。因此，迫切需要开发•OH生成能力更强的PS。研究表明，•OH是生物系统中最致命的ROS，可以有效地破坏生物膜结构。相比之下，I型PS通过电子转移过程产生•OH、O2−•和H2O2，以对氧依赖性更小、氧可循环性更强的方式克服缺氧微环境。因此，开发能够克服缺氧微环境的I型PS并探索其在治疗耐多药细菌生物膜方面的应用潜力意义重大，但目前极少有研究进行报道。

3）选择性差，生物安全性低。眼睛是最重要的器官，但不恰当的治疗方式（如万古霉素给药）会损害视力，甚至导致失明。然而，大多数PSs缺乏选择性，对真核生物产生细胞毒性和溶血活性，并在黑暗和光照射下加剧广谱抗菌活性，导致新的耐药性出现。然而，阳离子PSs不仅可以通过静电相互作用与细菌或生物膜结合，提高抗菌剂的通透性，而且还可以增强其对眼表上皮细胞的亲和力，从而延长药物保留时间，在低剂量下达到优异的治疗效果。

噬菌体是一种专门针对一种细菌物种中的一种或几种菌株的病毒。受体结合蛋白（RBP）是宿主特异性的关键决定因素，包括尾纤维、尾尖和尾尖。噬菌体的RBP引发其相应细菌宿主的感染，通过识别细菌细胞壁上的宿主受体、传递遗传信息并特异性杀死或转化其靶标发挥作用，与广谱抗生素相比，对正常微生物群的破坏更少，并减少了全身不良反应。研究表明，雷伯氏菌特异性噬菌体能够破坏多药耐药肺炎克雷伯菌的防御系统，改变膜电位、ROS反应，显示出使用噬菌体疗法治疗耐多药感染的优势。此外，噬菌体及其表面蛋白可以作为免疫原诱导免疫反应，通过吞噬作用调节先天免疫，并通过诱导抗体的产生来影响适应性免疫。

然而，在血流系统中，使用噬菌体定向清除生物膜（如眼表）具有挑战性。噬菌体清除生物膜的效率取决于噬菌体对生物膜的亲和力和扩散能力，而生物膜是流动系统中定向吸附的关键因素。由于噬菌体易感宿主的范围有限，噬菌体抗性细菌表型的出现、生物膜密度高、代谢活性低和群体感应机制等因素限制了噬菌体疗法治疗感染的有效性。因此，如何改善吞噬疗法在对抗生物膜感染方面的临床应用是一个至关重要的问题。利用噬菌体，可以优化PSs的精确靶向性，以提高选择性和生物安全性。反过来， PSs可以增强噬菌体的生物膜通透性，从而增加其清除生物膜的能力。此外，可以通过两种完全不同的机制来对抗多药耐药细菌和生物膜，有效减轻单一疗法以及天然噬菌体的狭窄宿主谱可能导致的耐药性。与基因工程噬菌体相比，上述策略更容易模块化，以便针对更广泛的多药耐药菌株进行个性化治疗。

图2 ACR-DMT的分子结构和光物理性质以及ACR-DMT修饰噬菌体的表征（摘自Advanced Materials ）

该研究了利用I型PS，ACR-DMT，结合对临床MDR-PA菌株特异的噬菌体，制备了治疗MDR-PA感染引起的BK的滴眼剂。正电荷不仅显著增加了对带负电MDR-PA的亲和力，还增强了抗菌光动力效应。此外，ACR-DMT实现了出色的HOMO-LUMO隔离和低δES-T，增强了系统间交叉（ISC）过程的高效性。该眼药水利用阳离子ACR-DMT臂噬菌体，对眼表面上皮细胞具有高度亲和力，明显抑制了MDR-PA感染，减轻角膜和虹膜水肿和穿孔，减少前房渗出和纤维化，并减少光学混浊。该眼药水还通过调节炎性因子的分泌、减少伤口中的免疫细胞浸润、增强T细胞分化、控制T细胞亚群比例、减少纤维化来保护眼组织，恢复视觉功能并防止长期不适和疼痛，成功促进伤口愈合过程且不留疤痕。这一创新性噬菌体滴眼剂能够高效、安全地治疗由MDR-PA感染引起的BK，是一种克服临床耐药性治疗各种眼表感染的有效的非侵入性治疗方法。