近期，浙大城市学院曾玲晖/刘一鸣团队揭示了肝癌细胞来源的GP73可以通过上调肝癌细胞VEGF表达，并通过外泌体形式进入到血管内皮细胞内，上调GRB2表达，通过同时激活血管生成相关通路的上下游，促进肿瘤微环境中血管生成。相关研究以题为“Golgi Protein 73 Promotes Angiogenesis in Hepatocellular Carcinoma”发表在Research上(Research,2024,39022745,DOI：10.34133/research.0425)。
Citation：Liu Y,Hu X,Zhou S,Sun T,Shen F,Zeng L.Golgi Protein 73 Promotes Angiogenesis in Hepatocellular Carcinoma.Research 2024;7:Article 0425.
https://doi.org/10.34133/research.0425
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研究背景
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，国内的乙型肝炎患者众多，乙肝是肝癌的高危因素，肝癌在国内呈高发态势，对肝癌的基础和临床研究成为当务之急。早期研究发现，高尔基体蛋白73（Golgi Protein 73，GP73）具有促进HCC生长和转移的功能。近年来，多项研究发现，GP73还具有重塑HCC微环境的作用。GP73可以通过上调肿瘤细胞PD-L1的表达，抑制CD8+T细胞的功能，促进肿瘤免疫逃逸；并造成巨噬细胞内质网应激，促进其向肿瘤相关巨噬细胞分化；甚至还可以通过外泌体GP73的形式对免疫细胞产生重编程效应，抑制肿瘤免疫。因此，大家普遍认为，GP73作为一个高尔基体、细胞质和胞外都具有分布的蛋白，可能存在复杂的促癌机制。深入探究GP73的促癌机制，有利于评估GP73是否可以作为一个有效的药物靶点，用于HCC的靶向及免疫治疗。
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研究进展
在作者的前期工作中，发现高表达GP73的HCC细胞形成的皮下移植瘤和转移瘤组织中的血管分布似乎较为密集，猜想GP73有可能促进HCC微环境中血管生成。通过临床样本的组织芯片，以及已发表文章的单细胞测序和空间转录组测序数据分析，证明了GP73确实可以促进HCC微环境中的血管生成。体外实验和动物实验证实GP73在常氧和缺氧条件下都可以促进血管生成，且缺氧条件下促进程度更高（图1）。
图1 GP73可以促进HCC微环境中的血管生成
由于GP73可以在缺氧条件下较大程度促进血管生成，作者认为GP73有可能在缺氧条件下通过上调HIF-1α，促进VEGF的分泌，从而促进血管生成。通过调取GEPIA2数据库中肝癌病人的RNA测序数据，发现GOLM1基因的mRNA表达和HIF1A基因下游signatures的表达呈高度正相关，尤其和VEGFA的mRNA表达相关性很高，这一结果验证了作者的假设。后续实验发现，GP73在缺氧条件下可以抑制HCC细胞内HIF-1α的泛素化，从而上调HIF-1α，继而促进HCC细胞VEGFA的生成和分泌，促进HCC微环境中血管生成（图2）。
图2 GP73稳定HIF-1α的表达，从而促进VEGFA的生成和分泌
后续研究中作者发现，GP73可以抑制HCC细胞内HIF-1α的P564羟基化，从而抑制其泛素化。免疫共沉淀和荧光共振能量转移实验证实，缺氧条件下，GP73可以直接结合PHD-2，暗示GP73可能通过使PHD-2失活，抑制HIF-1α的泛素化。后续实验证实GP73通过其无规卷曲结构域结合PHD-2，从而上调HIF-1α，促进VEGFA的生成和分泌（图3）。
图3 GP73竞争性结合PHD-2，抑制HCC细胞内HIF-1α的泛素依赖性降解
由图1的实验表明，GP73高表达的细胞即使在常氧下也能促进血管生成，因此研究者猜测GP73还可以通过非VEGFA依赖的形式促进HCC微环境中血管生成。由于前期多项研究指出，HCC细胞来源的外泌体GP73可以促进细胞生长和迁移，研究猜想其是否也可以作用于血管内皮细胞，促进血管生成。作者用含外泌体和去除外泌体的培养过HCC细胞的条件性培养基培养血管内皮细胞，发现去除外泌体的培养基促进血管生成能力明显变弱，验证了作者的假说（详见补充数据）。后续的体内外实验证明，HCC细胞来源的高表达GP73的外泌体可以明显促进体内外血管生成（图4）。
图4 HCC细胞来源的高表达GP73的外泌体可以促进血管生成
为研究高表达GP73的外泌体促进HCC微环境中血管生成的分子机制，本研究提取了HepG2和HepG2-GP73细胞的外泌体，处理血管内皮细胞，通过RNA-seq和GSEA分析发现高表达GP73的外泌体可以促进血管内皮细胞Ras通路的激活。后续实验表明，GP73可以抑制VEGFR下游接头蛋白GRB2的泛素化，从而上调其表达量。通过激活Ras-MAPK通路，促进HCC微环境中血管生成（图5）。
图5 HCC细胞来源的高表达GP73的外泌体通过稳定GRB2表达激活Ras-MAPK通路
为证实是否是高表达GP73外泌体中的GP73介导了这一效应，本研究又进行了后续验证。结果表明，正是外泌体中的分泌型GP73激活了血管内皮细胞中的Ras-MAPK通路（图6）。
图6 HCC细胞来源的外泌体GP73通过激活Ras-MAPK通路，促进血管生成
由于无规卷曲结构具有结合各种蛋白质的功能，前文实验中发现GP73可以通过无规卷曲结构竞争性结合PHD-2，因此研究认为，HCC细胞来源的外泌体GP73进入血管内皮细胞后，可以通过竞争性结合特定的E3泛素连接酶，抑制GRB2的泛素化。作者通过蛋白质谱筛选到一些候选底物，并通过进一步实验验证，发现GP73的底物之一，HECTD1可以促进GRB2的泛素化（详见补充数据）。后续实验证明，GP73可以竞争性结合HECTD1，抑制其介导的GRB2泛素化，通过抑制GRB2的泛素依赖性降解上调其表达，从而激活血管内皮细胞Ras-MAPK通路，促进HCC微环境中血管生成（图7）。
图7 GP73通过激活血管内皮细胞Ras-MAPK通路，促进HCC微环境中血管生成
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未来展望
本研究证明了GP73可以通过抑制HCC细胞HIF-1α的泛素化，促进VEGFA生成和分泌；以及促进血管内皮细胞GRB2稳定，同时激活VEGF-VEGFR通路上下游，从而促进HCC微环境中的血管生成。本研究证明GP73除了可以通过其胞质段介导肿瘤相关蛋白转运外，还可以通过无规卷曲结构域竞争性结合胞内蛋白，从而影响细胞信号，促进HCC发生发展。本研究证明了GP73可作为一个潜在的药物靶点，用于抗肿瘤血管生成的治疗。
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作者简介
浙大城市学院医学院讲师刘一鸣，浙江大学医学院附属邵逸夫医院博士生胡鑫暘和浙江大学生命科学研究院博士后周斯宁为本研究的共同第一作者，浙大城市学院医学院曾玲晖教授和刘一鸣为本研究的共同通讯作者。
本研究由国家自然科学基金青年基金和浙江省重点研发项目的支持。特别感谢浙江大学医学院附属邵逸夫医院金洪传教授对本研究的指导，以及浙江大学医学院附属邵逸夫医院的袁世进博士对本研究组学分析的帮助。
往期回顾
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10-2024
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10-2024
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