Research综述|mRNA递送载体脂质纳米粒研究进展—中国科学院过程所夏宇飞团队综述

中国科学院过程所夏宇飞团队撰写了综述讨论mRNA递送载体脂质纳米粒（LNP）、对LNP-mRNA的研究现状进行了回顾和讨论。相关文章以“Unlocking the Therapeutic Applicability ofLNP-mRNA: Chemistry, Formulation, andClinical Strategies”为题发表在Research上。

Citation: Huang X, Ma Y, Ma G,Xia Y. Unlocking the TherapeuticApplicability of LNP-mRNA:Chemistry, Formulation, and ClinicalStrategies. Research 2024;7:Article0370. https://doi.org/10.34133/research.0370

早在20世纪90年代，体外转录mRNA在小鼠体内翻译产生蛋白的学术研究第一次刊登在Science期刊上，为mRNA药物的恢弘的30年发展进程拉开了序幕。由于mRNA单链结构的天然不稳定性、体内的高免疫原性以及低效的体内递送效率，mRNA药物的发展速率一度受限放缓。直至2019年末，一场肆虐全球的“COVID-19风暴”，让mRNA疫苗取得巨大成功和空前关注，mRNA药物重新展现出其在疾病预防和治疗医疗领域的无限潜力。

作为mRNA递送的经典载体，四组分自组装的LNP（lipids nanoparticles）脂质纳米颗粒受到大量科学家的研究，但是目前LNP-mRNA药物的发展仍然面临挑战：

1、非肌肉、非肝脏细胞的精准靶向递送困难；

2、在蛋白替代疗法和基因编辑疗法中，不同于疫苗的高剂量对于生产、质控的更高要求；

3、更高剂量随之带来的生物安全性问题。

LNP被认为是安全、高效、高性价比、可规模化生产的mRNA递送体系；本篇综述专注于讨论mRNA递送载体LNP，对LNP-mRNA的研究现状进行了回顾和讨论。主要从LNP配方、靶向策略和大规模生产及表征探讨了克服mRNA药物临床转化障碍的潜在策略（图1）；从临床角度提供设计指导，强调生产和给药过程中增加mRNA稳定翻译策略，促进mRNA转运到肌肉和肝脏以外的靶器官。

图1  建立化学、配方、靶向递送和CMC方法来解决LNP-mRNA临床翻译的障碍

首先概述了可电离脂质、胆固醇、磷酸脂质和PEG脂质的最新进展（图2），阐明了它们的组成，并展示了LNP配方对增强mRNA包封、稳定性和递送的结构影响。

图2  在LNP配方中使用的可电离脂质，甾醇类，磷脂和PEG-脂质的例子

图3  高通量筛选的3部分可电离脂质促进了mRNA在体外和体内的有效传递

从化学角度看，可电离脂质类可分为头部、连接体和烷基尾部三部分，高通量组合文库筛选中的大多数脂类都是基于这三部分的随机组合，通过点击化学开发脂质文库，在短时间内合成大量脂质。Dr. Anderson和Dr. Langer's团队从1080种可电离脂质中，通过体外细胞转染效率和小动物活体转染效率评估筛选得到具有高效转染能力的可电离脂质（图3），进一步证明具有杂环阳离子头基的类脂多胺通过促进注射部位的STING通路激活，促进APC细胞分泌更高水平的细胞因子，从而提高其抗肿瘤效果。

图4  磷脂(a-d)和胆固醇(e-j)对LNP-mRNA靶向和递送效果的影响

磷脂和胆固醇都是作为结构成分在LNP的设计和功能中起着至关重要的作用。研究发现，通过更换磷脂、胆固醇的种类或调整其比例，可以实现更高的递送效率或非肝脏器官的高表达（图4）。如引入阳离子脂质DOTAP并将其比例从16%上调到40%，可以促进LNP-mRNA在肺的表达；而胆固醇可以通过化学修饰实现肝脏中T细胞转染比例的上调。

图5  选择性器官靶向(SORT)使脂质纳米颗粒(LNPs)的系统和可靠的工程精确mRNA递送到特定的器官

除此以外，有研究通过引入第五种脂质成分实现LNP-mRNA特异性器官靶向：Dr. Siegwart团队通过引入SORT 脂质，在LNP中引入带负电的18PA脂质促进脾脏的递送，添加带正电的DOTAP脂质促进肺的递送（图5）。

图6  LNP-mRNA组织靶向的表面修饰策略

除了上述LNP对可电离脂质、磷脂和胆固醇的操纵和优化在一定程度上使mRNA能够靶向递送到特定器官，还可以通过对LNP的表面进行修饰促进其靶向递送能力（图6）。

LNP表面聚乙二醇化调控血清蛋白吸附可以调节LNP的递送能力。PEG脂质作为一种具有两亲性的脂质，它在调节LNPs的清除率和半衰期以及稳定性方面起着至关重要的作用。PEG的长度、体内脱落动力学、吸附蛋白冠等研究均促进了LNP-mRNA的精准递送。

通常LNP的半衰期取决于PEG脂质的长度，PEG长度越长，血清成分的非特异性吸附就越弱，半衰期就越长；但是过长的PEG反过来又会不利于LNP与溶酶体膜的融合，限制了mRNA的溶酶体逃逸，这使得LNP药物递送陷入“PEG困境”的两难局面。

PEG脂质的体内脱落动力学研究也影响着LNP在注射后的命运，优化PEG脱落动力学可以改善LNPs在体内的循环和生物分布（脂肪链更长的PEG脂质，脱落速度更慢）。

PEG还会影响LNP表面吸附蛋白冠的组成和数量，进而通过蛋白冠与器官细胞受体之间的相互识别作用调节LNP的器官靶向性。

图7  CD3抗体 (aCD3)偶联LNP的特性及体内T细胞靶向递送效果

图8 CAR-T细胞在体内生成CD5靶向LNPs的示意图

除了调节PEG脂质，已经有通过在LNP的表面偶联主动靶向配体实现细胞或器官的精准递送。如图7所示，在LNP表面连接16%的CD3抗体尾静脉注射靶向T细胞，24h后检测实现了4% T细胞的转染。在LNP表面偶联CD5抗体，原位编辑得到CAR-T细胞，治疗心脏纤维化（图8）；实现了脾脏中81.1% CD4+T细胞和75.6% CD8+T细胞高效转染，进一步实现了心脏纤维化后功能的改善。虽然抗体修饰为精准递送提供了方案，但由于特异性低的抗体选择有限、工艺开发和质量控制困难等原因，该策略仍处于临床前阶段。

图9  加速LNPs设计的创新策略示意图

对于LNP的配方和表面修饰之外，Dr. Dahlman提出的条形码技术大大提高了LNP高通量筛选的效率（图9）。将不同LNP配方装载独特DNA条形码序列，共同静脉注射到单个小鼠体内，通过对不同组织中存在的条形码百分比进行深度测序，可以计算出不同LNPs在不同组织中的百分比。

图10  多色CICS平台仪器，LNP配方表征方法

在经过配方、表面修饰的优化后，一旦确定了固定的LNP配方，就需要以更苛刻的要求匹配商业化生产，充分考虑LNPs的合成扩大到GMP水平可能会带来的挑战。

储存：现有的商品化LNP-mRNA疫苗均需要低温保存、冷链运输，这在一定程度上限制了其广泛使用性。加入合适的冷冻保护剂，实现稳定的冻干或冷冻保存是mRNA药物发展所必须的。

表征：常规实验室的动态光散射粒度仪DLS对于LNP粒径、电位、PDI，以及包封率的检测，无法满足药物生产所需的严格标准；空载LNP颗粒的比例也没有确切的评估手段。有研究报道了一种基于多激光圆柱照明共聚焦光谱(CICS)技术在单纳米颗粒水平检测LNP配方中mRNA和脂质含量的方法（图10）；通过对LNP各组分荧光标记和单个mRNA分子荧光的重合和定量分析，区分了未包封的mRNA、空LNPs和装载mRNA的LNPs。这种方法可以为商业化生产提供范式。

安全性：目前对于LNP在体内的吸附、分布、代谢和消除(ADME)性能研究较少，当应用于蛋白替代疗法、基因编辑时，需要更大剂量的LNP-mRNA药物，面临更高要求的生物安全性挑战，因此ADME的分析研究更加迫切。

最后，从临床视角回顾了mRNA治疗的发展现状，介绍了mRNA在传染病疫苗、癌症个性化治疗和基因编辑在临床前的实验研究以及临床应用。

本文旨在通过增强LNP递送系统促进mRNA治疗和药物的开发，介绍了LNP- mRNA治疗的最新进展，LNP递送系统的结构和设计策略指南，以及临床前和临床发展趋势。本文同时也提出现今可能LNP-mRNA药物及疫苗发展的限速因素，主要提及LNP-mRNA组装过程不清晰，体内递送过程缺乏解析及相应的安全性难以平衡等观点，希望大家能对此多多关注。随着mRNA生物学、脂质化学和LNP配方的不断创新，以及靶向药物递送系统的增强，规模化生产的GMP和LNP的系统性表征，以及长期储存能力，可能使基于LNP-mRNA的创新疗法成为可能，为许多临床需求未得到满足的患者提供新的希望。

夏宇飞博士，现任中国科学院过程工程研究所研究员、国家基金委优秀青年计划获得者、 “中国科学院过程工程研究所-科兴控股先进佐剂及递送系统”联合实验室主任、生物药材料与生物剂型研究部副主任。师承高分子微球专家马光辉院士和疫苗纯化专家苏志国研究员，致力于微观界面作用过程对其宏观生物效应的影响，基于临床批准材料的疫苗佐剂与核酸递送系统研究。以第一/通讯作者在Nature Materials、Advanced Materials、ACS Nano等发表SCI文章18篇（6篇入选封面文章），申请专利10项（授权4项，其中1项日本专利）。Research青年编委、Scientific Reports编辑以及Journal of Visualized Experiments专刊客座编辑。先后主持国家自然科学基金委员会重大项目（课题主持）、国家重点研发计划战略性科技创新合作项目、中科院从0到1基础前沿科学研究计划等；入选了北京市科技新星、中科院青年创新促进会、北京市青年人才托举计划（免疫学会）等；获得了中国科学院院长特别奖、吴瑞奖学金、中国化工学会/京博优秀博士论文金奖（全国唯一）、中国颗粒学会青年颗粒奖、全球华人化工协会未来化工学者奖、国际疫苗协会优秀奖等。