Plant Cell Environ.: 山东农大解志红课题组揭示土壤磷水平决定农田菌群功能

低磷和高磷投入下，土壤微生物群重塑根系转录组导致对玉米生长的影响不同

Soil microbiota modulates root transcriptome with divergent effect on maize growth under low and high phosphorus inputs

有益微生物可以促进植物生长，有害微生物抑制植物生长。尽管对单一微生物物种与其宿主之间的相互作用过程进行了广泛的研究，但宿主对土壤微生物群的生长和转录反应知之甚少。我们从磷肥长期定位试验点收集自然或灭菌土壤并种植玉米，采用两种不同的土壤磷肥水平。我们研究了自然土壤中根系微生物群落的组成，同时，测定了在自然或无菌土壤中生长的玉米生物量、离子组和根系转录组。土壤微生物群可以促进或抑制不同的磷饥饿响应（PSR）基因，并不依赖于土壤磷水平，同时诱导几种与防御相关的代谢过程。长期施用磷肥导致玉米PSR和防御反应强度降低，抑制玉米生长。在低磷条件下，PSR和防御反应在更高程度上被诱导，促进了磷的吸收和生长。我们的研究结果表明，微生物群通过整合PSR和防御反应对玉米生长产生了土壤磷依赖性的影响，并为根系生长和土壤微生物群之间的相互作用提供了更深入的理解。

植物被无数影响植物健康的土壤微生物定植。土壤微生物群的有益成员可以通过抑制植物病原体、直接促进植物生长或增强植物对非生物胁迫的抗性来帮助其宿主。例如，根系栖息微生物可以调节扩散屏障的形成，重塑拟南芥中的植物离子体。相反，有害微生物会抑制植物根系或幼苗的生长。此外，许多微生物对植物的环境适应性没有直接影响，但可以通过群体感应和其他群体相互作用影响其他微生物的丰度或活性。

植物根系相关微生物群落主要受土壤类型的影响，在特定环境中保持相对一致。然而，一些微生物可以以磷酸盐（P）特异的方式调节植物生长和根系代谢。例如，C.tofieldiae仅在缺磷条件下将磷转移到植株中，促进拟南芥生长。生物和非生物因素的复杂相互作用，如土壤结构、养分和水的可用性，也与微生物群相互作用，并决定了微生物对植物的最终影响。例如，来自不同组成土壤的微生物群可以不同地影响水稻幼苗的生长表型。综上所述，微生物的多样生态功能和复杂相互作用需要全面评估。

另一方面，植物根系相关微生物群的组成动态已经得到了广泛的研究，但了解植物在不同环境下对不同微生物的定殖反应仍然是一个挑战。植物可以通过平衡生长和防御反应来同时应对各种压力。最近的研究证实，植物使用模式识别受体激酶CERK1来区分有益和有害的微生物，并特异性地介导植物的共生或防御反应。U-box泛素E3连接酶OsCIE1作为分子制动器抑制OsCERK1，促进或抑制防御反应。

防御反应的上调可能同时影响有益微生物的定殖，因此植物有一组分子开关，根据环境适应的需要协调防御和非生物胁迫反应的强度。拟南芥P饥饿响应（PSR）相关基因参与根际微生物群落的正常形成，关键因子PHR1调节PSR和防御反应，并由微生物群诱导。此外，植物PHRs SPXs模块参与调节缺磷条件下丛枝菌根的定殖。PHR和SPX的结合和解离充当分子开关，调节植物对磷有效性反应中的生长-防御trade-off。P转运蛋白基因家族的成员，如ZmPht1；6，也受到菌根真菌（AMF）定殖的显著诱导。PSR不仅是信号转导和磷稳态的调节模块，而且在调节植物和微生物群之间的相互作用中起着关键作用。然而，植物如何在转录水平上整合对土壤微生物群定殖的反应，以及磷水平如何影响这一过程，需要进一步研究。

玉米是最重要的作物之一，在这里，我们使用设置不同供磷水平的长期定位试验点的土壤，研究了微生物群对玉米生长、离子组和根转录组的影响。之所以选择长期实验地点，是因为土壤遗留效应可以形成相对稳定的植物-微生物相互作用。PSR基因和防御反应的不同反应是我们研究的重点。研究结果表明，PSR和防御反应以磷依赖的方式影响玉米生长。

图1 不同供磷水平下土壤微生物群对玉米生长的影响。

生长（a）、地上部和根的干重（b）、一级侧根密度（c）和总根长（d）。灭菌（S）土壤使用强度为25 kGy的γ射线照射消毒土壤3天，不灭菌的为对照（M）。LP，低磷。HP，高磷。PR，初生根。SR，种子根。FNR，第一节根。SNR，第二节点根。TNR，第三节根。FONR，第四节根。

为了密切监测根系代谢对土壤微生物群的响应，我们比较了在两种供磷水平下无菌土壤和自然环境中生长的样本之间的根系转录组差异。主坐标分析显示，与磷水平相比，微生物群对玉米根系的转录组有更显著的影响，在无菌土壤和自然环境中生长的根系之间的基因表达差异，一定程度上取决于土壤磷条件（图2a，b；补充表S4）。具体而言，598个（12%）转录本在两种P处理下都显示出不同的积累，而876个（18%）在HP条件下存在特异性差异，3513个（70%）转录本的数量在LP条件下存在特异性差异（图2b）。

在特定磷水平下，对土壤微生物群反应差异表达的基因被分为MAPMAN功能类别。使用Wilcoxon秩和检验，分析了在无菌土壤和自然环境中生长的根系之间上调和下调的功能类别的分布。在LP和HP条件下，MAPMAN的五个功能类别都得到了富集，包括“GRAS转录因子家族”、“次生代谢.黄酮类化合物”、“次级代谢”和“应激.生物”。在HP条件下，这些类别分别包含14、15、54和48个基因，在LP条件下分别包含13、29、102和85个基因（图2c，数据集S4-5）。

图2 不同供磷水平下，玉米根系转录组对土壤微生物群的响应差异。

（a）自然（M）或灭菌（S）土壤中生长的玉米根系转录组的整体差异。（b）维恩图说明M和S土壤在LP或HP投入下差异表达基因的重叠。（c）不同磷水平下，分别在灭菌和不灭菌土中生长的玉米根系中，显著富集且上调的代谢通路。

有趣的是，参与磷酸酶合成的13个基因（GRMZM2G2G152447、GRMZM5GG5G83836174、GRM2G2G017223、GRMZM2G2 G353551232、GRM2G2 G01414193、GRMZM2 G2 G01015908、GRMM2G09093101、GRMM2G 2G2G2G111425、GRMM5G2G881649、GRMM2GB 2G4040404769、GRM2G G031257、GRM2 G2 G2G004949、GRM2 G2G024144）在充足供磷的自然土壤玉米根中显著下调（图2c；数据集；S4）。在LP条件下，在自然土壤中生长的玉米根系中，功能类别“脂质转移蛋白（LTP）家族蛋白”、“混合细胞色素P450”、“细胞壁修饰”、“转运肽和寡肽”、“次生代谢苯丙烷类”和“激素代谢赤霉素”被特异性上调。其中，“脂质转移蛋白（LTP）家族”的Richfactor最高，为0.43，其中包括24个基因（图2c；数据集S5）。

为了探究微生物群对玉米生长的差异效应是否源自微生物群的组成差异，我们分析了根和根际土壤的群落结构。共鉴定出4547个细菌OTU和807个真菌OTU（数据集S6-8）。主坐标分析表明，生态位是影响细菌和真菌群落结构的主要因素。长期施用磷肥并没有显著改变玉米根系和根际的微生物群落结构和多样性（图3a，b；补充表S5）。进一步地，我们选择了30种丰度最高的细菌和真菌进行进一步分析。细菌群落主要由鞘氨醇单胞菌、链霉菌、Devosia等组成，其丰度主要呈负相关。例如，鞘氨醇单胞菌与其他几个属表现出显著的负相关。长期施用磷肥对一些属的丰度影响较小，如溶杆菌属和类芽孢杆菌属。真菌群落主要由Phalus、Acremonium、Ustilago等组成，Phalus丰度主要与其他真菌呈负相关，而其他真菌之间存在正相关。长期施用磷肥对根瘤菌和根瘤菌的丰度也有影响（图3c，d）。

利用16S rDNA和ITS序列预测玉米根系和根际细菌和真菌微生物群落的潜在功能。细菌群落功能主要与化学异养、好氧化学异养等途径有关。对于真菌群落，一半的丰度被归类为腐生型真菌，大约四分之一是寄生真菌，包括植物病原体。外生菌根真菌在真菌群落中也大量存在。然而，不同处理间，在栖息于根系相关生态位的微生物群落的功能分类中没有观察到显著差异（图3e，f；数据集S9）。

图3 施用不同磷肥的玉米根系和根际土壤（RS）中的微生物群落结构及其预测功能。

（a，b）使用根中细菌和真菌群落的Bray-Curtis距离进行无约束主坐标分析（PCoA）。（c、d）细菌和真菌前30属的分类、丰度和相关性。丰度相关性分析使用了相关系数阈值为0.5，p值阈值为0.05。（e，f）基于16S的细菌和真菌群落的功能分析分别使用FAPROTAX和FUNGILD进行。

为了验证根系代谢的变化会影响植物离子吸收的观点，我们分析了玉米的离子组，发现磷浓度对茎和根中的微生物群最敏感。在低磷和高磷条件下，微生物群都增加了玉米植株的磷浓度。与其他处理相比，除了磷，低磷灭菌土壤中玉米地上部其他营养元素的浓度更高，这表明在LP条件下玉米生长的严重抑制主要是由于磷获取不足（图4a）。除了磷，微生物群还增加了根中的氮浓度，同时降低了铁和锰浓度（图4b）。在HP条件下，微生物群减少了所有元素的积累，但对地上部和根中的P以及茎中的Mg几乎没有影响。相比之下，在LP条件下，微生物群显著增加了所有元素的积累。具体而言，根中的钙、氮和磷含量以及地上部中的磷含量显著增加（图4c；补充表S6-7）。

图4|土壤微生物群对不同磷制度土壤中玉米离子体的影响。

地上部（a）和根（b）的营养元素浓度，以及地上部和根中元素含量增加百分比（c），计算方法为自然土壤和无菌土壤中的差值除以无菌土壤。M，自然土壤。S，消毒土壤。LP，低磷。HP，高磷。

AMF可以显著促进宿主植物对磷的吸收，因此我们研究了不同处理间AMF的定殖水平。与HP相比，LP下玉米根中诱导了更高水平的AMF定殖（图5a）。此外，我们使用带有AMF特异性引物的巢式PCR分析了AMF群落，并确定Glomus是在根和根际土壤中定居的主要属（图5b，数据集S10）。

基于先前鉴定的玉米PSR基因，我们对它们在微生物和磷水平下的表达进行了详细分析。我们对161个基因进行了FPKM对数转换，然后进行了方差分析，并确定了四种处理之间存在显著差异的71个基因（图5c，数据集S11）。根据它们的表达模式，这些PSR基因分为五组。第1组包含23个主要受玉米植株磷浓度调节的基因，在缺磷的情况下显著上调。第5组由7个基因组成，其表达模式与第1组相反，在缺磷的情况下表现出显著的抑制作用。第3组包括6个在HP_S处理下高度表达的基因（图5c，数据集S11）。

第4组包含10个基因，其表达受土壤微生物群上调，包括MGD3、PHO1、Pht1；11，Pht1；13（两个冗余基因），Transketolase，PHF1，Pht1；6、WRKY42和Rip。值得注意的是，Pht1；6和Pht1；11个是菌根定殖的标记基因，以前报道过菌根定殖会显著诱导它们表达。第2组包括25个基因，如SPX1、SPX2、ZmSHR等，其表达模式与第4组相反，主要受土壤微生物群的下调（图5c，数据集S11）。

图5 土壤微生物群对在不同供磷土壤中生长的玉米PSR基因表达的影响。

两种不同供磷水平玉米根系中菌根定植率，丛枝丰度、丛枝菌根真菌（AMF）的群落组成（a，b）以及磷饥饿响应相关基因的表达水平的。M，自然土壤。S，灭菌土壤。LP，低磷。HP，高磷。

为了揭示PSR基因与MAPMAN中功能类别之间更普遍的联系，我们在HP条件下使用STRING算法构建了一个功能连接网络，其置信水平>0.4。该分析确定了38个编码蛋白质的基因，这些蛋白质是生物连接的（数据集S12）。这些基因与“PSR”、“黄酮生物合成”、“苯丙烷代谢过程”、“防御反应”和“萜类生物合成过程”等途径有关（图6a）。

在“PSR”通路中，7个基因（ZmSHR1、ALS1、PAL3、Transketolase、ATPPC1、ATPPC2和CCD8）属于图5中的第1、2、4和5组。这些基因不仅在PSR中起着直接作用，而且可能与参与玉米和土壤微生物群相互作用的其他基因相互作用，表明PSR与微生物群诱导的防御反应之间存在内在关系。例如，微生物群存在上调的Transketolase可能与萜类生物合成过程相互作用。此外，我们分析了这38个基因在四种处理中的表达水平（FPKM）的相关性。除4个PSR基因外，大多数基因彼此呈正相关。在PSR基因中，Transketolase和CCD8与其他基因呈正相关，而ATPPC1、ATPPC2、ALS1和ZmSHR1与其他基因呈负相关（图6b）。

此外，我们分别对玉米根和地上部中离子组和基因表达水平进行了Mantel分析。Lac1、PAL、B4FJW4_MAIZE和ATPPC2的表达水平与根中P的浓度显著相关。ATPPC1表达水平也与根中N、Ca和B浓度以及根干重显著相关。有趣的是，根中的Fe浓度与许多基因表达水平显著相关，突显了其在玉米根和土壤微生物群相互作用中的作用（图6b；数据集S13）。相比之下，ZmSHR1和ATPPC2的表达水平与地上部中的B、Mn和P浓度显著相关。ATPPC1表达水平与茎中N、Ca和Cu浓度以及地上部干重显著相关。此外，TPS8的表达水平与地上部中的P、Mn、K和Zn浓度显著相关（补充图S1；数据集S13）。

图6 玉米中PSR、微生物群诱导反应和离子组的相互作用网络分析。

（a）在高磷（HP）条件下基因的互作网络可视化。（b）基因之间表达水平的成对比较相关系数。使用Mantel检验将根离子组与基因表达水平相关。

图7 P水平依赖的PSR和防御反应互作网络以及对玉米生长的影响模式图。

参考文献

Wang, C., Tai, H., Chen, Y., Zhai, Z., Zhang, L., Pu, Z., ... & Xie, Z. Soil Microbiota Modulates Root Transcriptome With Divergent Effect on Maize Growth Under Low and High Phosphorus Inputs. Plant, cell & environment. DOI: 10.1111/pce.15281