2024的国自然刚结束不久，就有人开始预测2025年的国自然热点了。小薇师姐也是抓紧时间统计了一下今年的国自然热点，发现免疫研究依然处于领先地位，但同时也有几个黑马出现，如乳酸化，T细胞等研究热度也是在逐渐升高。刚好今天小薇师姐想给大家分享的这篇文献直接汇聚了国自然中的三大热门方向，创新性直接拉满，速看速看！
这篇文献是上海交通大学马海龙团队今年9月在Cell Reports上刚刚发表的。文中以乳酸化和T细胞出发点，结合代谢重编程分析对头颈鳞状细胞癌（HNSCC）患者恶性细胞中的H3K9乳酸化促进CD8+ T细胞功能障碍和免疫治疗反应的相关性进行研究，这在目前的HNSCC治疗的研究中可谓是相当出彩了。那么具体有何创新性呢？
1.文章首次利用了代谢重编程的方法对H3K9乳酸化促进CD8+ T细胞功能障碍和免疫治疗反应进行分析，为探究HNSCC的治疗机制提供新的依据。
2.多组学分析的方法全面揭示了H3K9乳酸化修饰在肿瘤免疫逃逸中的调控网络。
3.本文的研究不仅停留在分子机制层面，还探讨了靶向IL-11恢复CD8+ T细胞功能并增强免疫治疗反应的潜力，为开发新的治疗策略提供了实验依据。
4.本文通过胆固醇修饰的siRNA技术，提高了siIL11的稳定性和细胞摄取效率，为肿瘤免疫治疗提供了一种新的高效药物递送方法。
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题目：恶性细胞中的H3K9乳酸化促进 CD8+ T细胞功能障碍和免疫治疗反应差
期刊：Cell Reports
影响因子：7.5
发表日期：2024年9月
公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20241025
研究背景
头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是一种常见的头颈部癌症，患病后生存率较低，严重影响患者的生活质量。虽然目前免疫检查点阻断（ICB）在癌症治疗中取得了一些进展，但绝大多数患者因药物抗性和复发而未能受益。有研究发现肿瘤微环境（TME）中的乳酸积累与免疫逃逸有关，而H3K9乳酸化（H3K9la）在调节免疫逃逸中具有关键作用，可能成为改善HNSCC免疫治疗的潜在靶点。
研究思路
本文通过观察发现HNSCC患者中H3K9la水平升高与免疫治疗反应不佳相关，之后利用CUT&Tag技术和RNA测序筛选出H3K9la的下游靶基因IL-11，并通过体外实验进行了验证，最后在临床样本结果中分析H3K9la与IL-11表达是否具有相关性，进一步揭示H3K9la/IL-11轴在HNSCC免疫逃逸中的作用。
主要结果
1.全乳酸化上调表明HNSCC患者对免疫治疗有不良反应
为了研究乳酸化修饰与HNSCC免疫治疗反应之间的关系，研究者对对术前接受诱导免疫治疗的患者进行了探究，并根据术后病理检查情况将患者分为病理缓解/病理完全缓解（MPR/pCR）组和非MPR组，即有反应组和无反应组（图1A）。研究者首先发现免疫治疗前无应答组的血清乳酸脱氢酶A (LDHA) 浓度高于应答组（图1B）。其次，与MPR/pCR患者相比，非MPR患者蛋白质乳酸化水平显著更高（图 1C 和 1D），表明蛋白质乳酸化可能与HNSCC患者的免疫治疗效果相关。随后，研究者分析了138个HNSCC组织和84个正常口腔粘膜样本的组织微阵列中的乳酸化修饰，免疫荧光结果显示HNSCC组织中的PKla水平显著高于健康口腔粘膜样本（图1E和1F）。此外，研究者发现高乳酸化修饰水平与晚期 TNM 分期相关，与患者其他特征无关（图1G）。这些结果表明，乳酸化水平升高与HNSCC患者对免疫治疗的不良反应相关。
图1 泛乳酸化水平上调揭示了患者对免疫治疗的不良反应
2.H3K9la是HNSCC的一种特定修饰物
为了研究HNSCC中乳酸产生与细胞生长之间的关系，研究者对常氧和低氧条件下培养基中的细胞乳酸水平进行了分析。研究发现在常氧和缺氧条件下，乳酸浓度均随时间依赖性增加，最高浓度约25 mM（图2A和2B），同时发现PKla也出现了相同的结果（图2C和2D）。对缺氧条件下特定PKla位点的检测结果表明了组蛋白上结构乳酸化位点上调（图2E）。研究者通过半定量分析发现两种细胞系中H4K5la、H3K9la 和 H3K18la水平发生上调（图 2F）， 这一结果在不同时间的乳酸处理这三个位点的修饰水平的分析中得到了验证（图 2G）。
研究者通过不同浓度葡萄糖处理细胞的方法评估葡萄糖和组蛋白乳酸化的相关性，结果表明，H4K5、H3K9 和 H3K18 的乳酸化修饰以葡萄糖依赖性方式增加（图2H）。同时进一步的调节机制分析表明2-脱氧-D-葡萄糖 (2-DG) 和草酸盐 (OXA) 会干扰细胞内源性乳酸的产生，降低H3K9乳酸化水平（图2I），并且H3K9乳酸化的下调对乳酸转运功能具有抑制作用（图2J）。这些结果表明乳酸在诱导组蛋白乳酸化修饰中发挥着重要作用，特别在H3K9处。
图2 H3K9la是HNSCC细胞系中的一种特异性修饰
3.H3K9la 潜在下游靶标的鉴定
为进一步确定HNSCC中H3K9la调控的下游基因，研究者在用或不用乳酸处理的HNSCC细胞系中对H3K9la进行了CUT&Tag测定（图3A）。检测结果表明H3K9la与大多数基因的转录起始位点(TSS)附近的位点结合，乳酸处理组中H3K9la的结合富集峰显着高于对照组（图 3B）。同时，峰分布分析显示，在CAL27和HN30 HNSCC细胞系中，分别有43%和47%的差异H3K9la结合峰位于启动子区域内（图 3C）。GO分析和KEGG分析揭示了Ras、PI3K/AKT和JAK/STAT信号通路与恶性肿瘤的发生有关（图3D）。
研究者通过RNA 测序 (RNA-seq)鉴定在免疫逃避中起关键作用的H3K9la 调控基因，分析发现11 个候选基因 LIMA4、IL11、SMARCA2、SLC52A3、RASSF4、MTFR1L、ARID1A、CIT、TNS3、ABR 和 ZNF668 发生上调（图3E）。染色质免疫沉淀 (ChIP)-qPCR结果表明H3K9la对IL11的富集在乳酸处理中最为显著（图3F），同时，基因浏览器图也显示IL11的H3K9la结合区域（包括启动子和其他区域）水平增加（图3G）。这些结果表明IL11可能是HNSCC中H3K9la的下游调控靶点。
此外，研究者在对细胞进行缺氧处理后发现H3K9la的结合富集峰显著升高（图3H）。峰分布分析也表明，34%的H3K9la结合峰位于HN30细胞的启动子区域内（图3I）。
图3 H3K9la潜在下游靶点鉴定
4.IL-11是H3K9la 的靶标
为了验证乳酸的调节作用，研究者检测了乳酸处理后细胞中IL-11的蛋白和RNA表达水平。研究结果发现IL-11的表达呈乳酸依赖性，治疗剂量和持续时间也会影响其表达（图4A-D）。此外，研究者发现缺氧诱导因子1a（HIF-1a）的表达在大约6小时达到峰值，此后逐渐下降，证实了缺氧培养条件的建立（图4E），表明了IL-11的表达在缺氧条件下不受HIF-1a的调节。
为进一步研究乳酸处理对IL-11表达的影响，研究者使用葡萄糖、2-DG 和 OXA 对乳酸产生情况进行分析。分析结果表明，IL-11蛋白表达依赖于葡萄糖浓度（图4F），并且 2-DG 和 OXA 的存在会降低 IL-11表达（图4G-H）。培养基的IL-11水平的检测结果显示，与肿瘤细胞中IL-11表达趋势一致，乳酸处理也提高了 IL-11的分泌水平（图4I-J），并且高葡萄糖和低氧水平显着增加了IL-11的分泌（图4K-L）。此外，研究者发现在缺氧条件下抑制内源性乳酸的产生会显著减少IL-11的产生（图4M-N）。这些结果表明细胞缺氧条件下会通过乳酸诱导IL-11的产生。
研究者通过脱乙酰酶抑制剂MS-275探究组蛋白乳酸化与IL-11水平之间的关系，结果观察到使用抑制剂后H3K9la和IL-11表达均显著增加（图4O），同时观察到IL-11和H3K9la之间存在协同效应（图4P）。此外，研究还发现乳酸刺激并不影响HNSCC细胞中H3K9的乙酰化或甲基化（图4Q），ChIP-PCR结果也显示乳酸刺激后 H3K9me、H3K9ac 和 IL-11 的结合富集没有显着差异（图4R）。这些结果表明H3K9乙酰化和甲基化并不参与H3K9乳酸化对IL-11的调节机制。
图4 IL-11是H3K9la的靶点
5.IL-11通过JAK2/STAT3信号通路促进CD8+ T细胞中免疫检查点的表达
为了确定IL-11和乳酸的潜在靶细胞，研究者利用在线数据库TIMER 2.0对HNSCC患者不同类型免疫细胞中LDHA和IL-11水平之间的相关性进行评分。分析发现IL-11表达水平与多种免疫细胞相关，其中与T细胞，尤其是CD8+ T细胞，具有最高的Pearson相关系数，表明LDHA与CD8+ T细胞存在差异相关性（图5A）。研究通过下游信号激活的水平分析发现IL-11浓度较高时，JAK2/STAT3信号通路比ERK1/2和AKT信号通路更容易激活，并且几个免疫检查点（PD1、TIGIT、CTLA4、TIM3 和 VISTA）的表达也明显增强，IL-11治疗期间 CD8+ T细胞和Jurkat细胞均显著增加（图5B-C）。流式细胞术分析表明CD8+ T细胞中 PDCD1、VSTM3、CTLA4 和 HAVCR2 的 mRNA 表达水平升高，同时IL-11浓度水平也显著升高（图5D）。
研究者对STAT3为免疫检查点分子的转录因子进行了假设，通过对CD8+ T和Jurkat细胞中的磷酸化 STAT3 (p-STAT3) 进行了 ChIPqPCR 分析。分析结果表明在CD8+ T 和 Jurkat 细胞中，IL-11 处理组能够显著增加 p-STAT3 与 PDCD1、VSTM3、CTLA4 和 HAVCR2 启动子的结合（图5E-F）。
为了进一步验证STAT3如何调节免疫检查点表达，研究者通过STAT3抑制剂或STAT3敲低抑制STAT3的活性，研究发现IL-11治疗对 PD1、TIGIT、CTLA4、TIM3 和 TIM3的上调具有积极作用，而VISTA被阻止（图5G-H）。此外，研究发现在IL-11治疗期间，CAL27和HN30细胞中主要组织相容性复合物（MHC）I类、程序性死亡配体1（PD-L1）和PD-L2的表达以剂量依赖性方式增加（图5I）。以上结果表明 IL-11 可能通过对癌细胞和 CD8+ T细胞的独立作用来诱导免疫细胞功能障碍。
研究者从OT1小鼠中分离出卵清蛋白 (OVA) 特异性T细胞受体转基因 CD8+ T细胞，并用表达OVA的慢病毒转染SCCVII细胞（图5J）。在2:1的效应子与靶标(E:T)比率下，研究者发现IL-11诱导的CD8+T细胞对SCCVII细胞的细胞毒性比未处理的CD8+T细胞更小(图5K和5L)。这些结果表明IL-11损害CD8+T细胞的体外杀伤能力。
图5 IL-11通过CD8+ T细胞中JAK2/STAT3信号通路促进CD8+ T细胞中的免疫检查点的表达
6.IL-11过表达促进 CD8+ T细胞功能障碍和肿瘤进展
为了进一步确定 IL-11 在肿瘤发生和免疫调节中的作用，研究者对IL-11过表达进行了分析，研究发现IL-11 过表达组的肿瘤生长更具侵袭性（图6A-B）。但与对照组相比，肿瘤浸润 CD8+ T 细胞的计数并未受到显著影响（图6C-D）。Ki67染色的流式细胞术结果显示IL-11过表达组中Ki67+CD8+T细胞的百分比降低（图6E），表明CD8+T细胞的增殖能力降低。
此外，研究发现在IL-11过表达组中，肿瘤中 PD1+、TIGHT+、CTLA4+ 和 TIM3+ CD8+ T 细胞的百分比显着升高（图6F）。随着IL-11的过表达，T细胞的细胞毒功能也受到影响。干扰素-g+ (IFN-g+) 和颗粒酶 B+ CD8+ T细胞的比例显着下降（图6G）。多重免疫荧光染色结果显示，IL-11过表达组中CD8+ PD1+细胞的百分比也有所增加。SCCVII组过表达IL-11的Ki67+细胞显著增加，TUNEL+细胞显著减少（图6H-I），表明IL-11过表达可以促进肿瘤进展。
图6 IL-11过表达促进CD8+ T细胞功能障碍和肿瘤进展
7.IL-11 的阻断可逆转乳酸诱导的体内 CD8+ T细胞功能障碍
本研究中的体内实验表明乳酸对肿瘤生长的促进作用可以通过IL-11敲低来恢复（图7A-B）。流式细胞术结果显示，IL-11 敲低组和乳酸治疗组之间 CD8+ T细胞浸润没有显著变化，施用抗CD8+抗体后几乎没有检测到 CD8+ T细胞（图7C）。然而，shIL-11组中PD1+、TIGIT+、CTLA4+ 和 TIM3+ CD8+ T 细胞的百分比显着下降（图7D），同时，CD8+ T细胞中的IFN-g和粒酶B水平因IL-11抑制而上调（图7E），并且shIL-11组中Ki67+CD8+细胞的百分比增加，这些结果表明IL-11敲低后，乳酸介导的T细胞杀伤功能具有抑制作用。
图7 IL-11阻断逆转乳酸诱导的CD8+ T细胞功能障碍
8.胆固醇修饰的siIL11提高免疫治疗的效率
为了探索靶向IL-11在调节肿瘤免疫中的治疗作用，研究者设计并合成了胆固醇修饰的siIL11，并将其与荷瘤小鼠中的抗PD1或抗CD8+组合（图7F）。根据生存分析结果发现，同时接受抗PD1和胆固醇(chol)-siIL11治疗的小鼠比单一治疗组小鼠的生存时间更长(图7G-H)。使用chol-siIL11或抗PD1时，CD8+ 细胞的比例显著增加。此外，在联合治疗组中观察到肿瘤中 CD8+ T细胞浸润的百分比高于单一治疗组（图7I-J），而施用抗CD8+抗体后几乎没有检测到CD8+T细胞。同时，研究发现在chol-siIL11治疗后（联合或不联合抗PD1治疗），PD1+、TIGIT+、CTLA4+和TIM3+ CD8+ T细胞的比例显著下降（图7K）。联合治疗产生的 T 细胞杀伤功能显著高于chol-siIL11或抗PD1单独治疗产生的T细胞杀伤功能（图7L）。上述结果表明，用 chol-siIL11 靶向此处确定的 IL-11 的治疗显著逆转了T细胞杀伤功能，并提高了抗 PD1 联合治疗的功效。
9.H3K9la与IL-11表达证明HNSCC患者的免疫治疗反应不佳
研究者通过HNSCC组织微阵列分析检测了IL-11和H3K9la的表达水平，并以此探讨临床环境中IL-11和H3K9la之间的相关性。H3K9la +组的 IL-11 免疫反应评分显着高于H3K9la组。同时多重免疫荧光测定显示，无应答患者的H3K9la表达高于应答者，并且应答者 TME 中存在更多 CD8+ T细胞浸润（图7M）。
文章小结
本研究首先揭示了H3K9乳酸化在HNSCC中的重要性，发现其与免疫治疗反应不佳相关；随后确定了IL-11作为H3K9乳酸化的下游靶基因，并证明其通过JAK2/STAT3信号通路促进CD8+ T细胞耗竭；最后揭示抑制IL-11可以恢复CD8+ T细胞功能，增强免疫治疗效果。本篇文章的内容实在是太丰富了，但是思路清晰，想要复现的话并不困难。文中以HNSCC为研究疾病，那我们就换一个疾病，采用相同的思路你也可以拥有一篇一区文章。如果你对此心动了，就快来联系小薇师姐吧！选择研究热点，课题设计，定制分析，服务器租赁，你需要的这里都有，快来滴滴小薇师姐吧！
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