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《Biomedical Optics Express》
斑马鱼作为研究人类血液疾病的关键模型，常通过荧光显微镜（FLM）观察表达绿色荧光蛋白（GFP）的红细胞（RBCs）来探究细胞过程和生物学功能。然而，培育可靠 GFP 表达的转基因斑马鱼既耗时又费力，且卵黄的自发荧光和 GFP 有限的荧光寿命会干扰观察效果。为此，本文提出了一种无标记的活体光声显微成像系统，用于鉴定斑马鱼胚胎中的脑出血（ICH）和溶血性贫血（HA）。研究发现，该系统在识别转 LCR-EGFP 基因斑马鱼的 ICH 和 HA 方面与 FLM 效果相当，且在避免自体荧光问题上更具优势。此外，该系统还对透明的无荧光标记的 Casper 斑马鱼进行成像研究，而 FLM 因缺乏荧光标记无法观察 Casper 斑马鱼。综上所述，活体光声显微成像系统作为一种研究斑马鱼血液疾病的有力工具，具有以下显著优点：一是通过 RBCs 的内在吸收实现可靠成像结果；二是对多种斑马鱼品系具有广泛的适用性，无需依赖转基因技术；三是相比 BFM，在 ICH 和 HA 的鉴定中展现出更高的灵敏度。
研究重点
斑马鱼作为一种脊椎动物模型，因其繁殖力强、体型小、体外发育以及胚胎阶段良好的光学透明度等优点，被广泛用于研究发育过程和人类疾病的细胞分子机制。近年来，斑马鱼模型也被用于研究人类疾病和探索新疗法。荧光显微镜（FLM）常用于斑马鱼的研究，其一般需要依赖荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 GFP）来标记细胞，但这种方法存在一些问题，如难以找到合适的启动子、荧光蛋白半衰期长影响动态过程监测、背景自荧光干扰等。
活体光声显微成像系统是一种新型高分辨成像工具，能够利用红细胞（RBCs）的内在吸收对比度进行成像，无需进行荧光标记，从而提供了一种新的、非侵入性的成像方法，有望在斑马鱼血液疾病研究中发挥重要作用。
本文基于无标记活体光声显微成像系统，对活体斑马鱼中用于血液疾病的研究，特别是针对脑出血（ICH）和溶血性贫血（HA）两种疾病模型。并与荧光显微镜（FLM）和明场显微镜（BFM）进行了比较，展示了光声显微成像系统在识别 ICH 和 HA 方面的有效性和敏感性。
图1. 72小时大的转基因 Tg(LCR-EGFP)斑马鱼胚胎和 Casper 斑马鱼胚胎的 BEM、FLM 和光声显微成像结果。
光声显微图像与 FLM 图像在血管结构上表现出良好的一致性，能够清晰显示沿斑马鱼身体的主要血管。光声显微图像在两个方面优于 FLM 图像：一是光声显微图像对比度高于 FLM 图像；二是光声显微图像中没有明显的光散射，特别是大脑和心脏的血管可以更好地可视化。这些图像表明活体光声显微成像在显示斑马鱼血管结构方面具有与 FLM 媲美甚至更好的能力，并且在避免自荧光和光散射问题上具有明显优势。此外，光声显微成像系统能够成功地对缺乏荧光标记的 Casper 斑马鱼胚胎进行成像，这进一步证明其在斑马鱼疾病模型研究中的潜力和灵活性。
图2. 明场显微镜和活体光声显微成像系统对 Casper 斑马鱼胚胎脑出血（ICH）模型的成像结果及统计研究。
利用阿托伐他汀（Atorvastatin，ATV）处理斑马鱼胚胎来构建脑出血（ICH）模型。在对照组中活体光声显微图像显示正常的血管结构，与 BFM 图像一致，没有明显的 ICH 迹象。而在实验组中，BFM 图像可以观察到轻微 ICH 迹象，而活体光声显微图像 ICH 迹象更加明显，活体光声显微成像系统的高对比度使得 ICH 的识别更为容易。这些结果强调了活体光声显微成像系统在识别 ICH 方面的优势，尤其是在缺乏荧光标记的斑马鱼模型中。这些发现为活体光声显微成像系统在斑马鱼疾病模型研究中的应用提供了有力的支持。
图3. 明场显微镜和活体光声显微成像系统对 Casper 斑马鱼胚胎溶血性贫血（HA）模型的成像。
通过使用苯肼盐酸盐（Phenylhydrazine hydrochloride，PHZ）处理斑马鱼胚胎来构建斑马鱼胚胎溶血性贫血（HA）模型。BFM 图像在对照组和 HA 组都显示了正常 Casper 斑马鱼胚胎的血管模式，没有明显的异常。而 HA 组的活体光声显微图像相比正常组而言，大多数血管的光声信号显著减弱（例如，背主动脉 DA 和主静脉 CV），一些血管变得紊乱或消失，这些现象都表明红细胞（RBCs）受到损伤。这些实验证明了活体光声显微系统的高对比度优势：活体光声显微成像系统在识别 HA 方面具有更高的对比度和敏感性，使得 HA 的检测更为容易和准确。活体光声显微成像系统能够清晰地显示血管的紊乱和 RBCs 的损伤，这些在 BFM 图像中几乎无法识别。
活体光声显微成像系统的高对比度和敏感性使其成为研究斑马鱼疾病模型的有力工具，为未来在斑马鱼模型中进行人类疾病活体成像研究提供了新的方法和思路。
论文信息：
Label-free photoacoustic microscopy: a potential tool for the live imaging of blood disorders in zebrafish
原文链接：
https://doi.org/10.1364/BOE.425994
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