循环系统中存在许多不同的免疫细胞以及其他细胞成分，如血小板和红细胞。红细胞（RBCs）最丰富，其次是中性粒细胞和淋巴细胞。免疫细胞可分为单个核细胞（单核细胞和淋巴细胞）或多形核细胞（粒细胞）[1]。
目前已经开发了许多方法从血液中分离各种细胞类型，密度梯度离心法便是一种常用方法，保持较高的产量和较低的成本。细胞分离后，可用于多种应用，包括 1）进一步纯化更多特定细胞亚群，2）使用流式细胞术进一步鉴定和定量细胞群，或 3）进行细胞培养，以研究对各种刺激的反应。
什么是密度梯度离心？
密度梯度离心法是一种根据细胞密度差异分离细胞群的方法。将指定密度的分层液与样品（如全血）混合，然后离心。基于分层液的密度以及细胞的浮力密度差异，不同免疫细胞群将沉降在分层液的不同位置。粒细胞（中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞）是比重最大的细胞，其次是单核细胞，然后是淋巴细胞（B 细胞、T 细胞、NK 细胞）[1,2]。
全血中含有各种免疫细胞：单个核细胞（单核细胞和淋巴细胞）和多形核细胞（粒细胞）。密度梯度离心法可将免疫细胞与红细胞、血小板和血浆等其他全血成分分离。
分离单个核细胞
为分离淋巴细胞，将全血置于约 1.077 g/mL 的分层液中。使用该密度的分层液将分离出所有单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）[1]。离心后，粒细胞和红细胞将在底部沉淀，在分层液液面上有一层单个核细胞。这些细胞可以进一步纯化成 T 细胞或 B 细胞等特定细胞群。
从淋巴细胞中分离单核细胞
单核细胞由于比重较低且略大，可采用密度梯度离心法进一步从淋巴细胞中分离出单核细胞。这种分离可以通过两个不同密度层的组合[3]或一个密度层[4]完成。离心后，可在淋巴细胞或其他全血成分的上一层发现单核细胞。
分离单核细胞的两个技巧：
• 避免过度涡旋，这可能会激活或杀死细胞。
• 离心后可能存在残留的红细胞，可使用低渗裂解法去除。
分离粒细胞
分离粒细胞通常需要略不同的梯度方案。由于它们的比重更大，因而需要更高密度的分离液与红细胞分离（接近 1.1 或 1.2 g/mL）。
例如，一种常用方案是甲泛影钠和葡聚糖 500[5]的混合物。这将产生六层梯度（从上到下）：血浆、单个核细胞、分离液、粒细胞、更多分离液和红细胞。该梯度可以分离开粒细胞和大多数红细胞，并且相对于其他分离方法（如微珠选择）也有更高的产量[6]。不过，通过密度梯度离心法分离粒细胞后可使用微珠筛选特定细胞群，如嗜酸性粒细胞或中性粒细胞。任何残留的红细胞仍需要裂解。
在分离过程中减少细胞死亡和多形核细胞活化的三个技巧：
• 细胞的处理时间不要过长，特别是中性粒细胞的寿命很短。
• 避免将细胞「挤压」太紧，从而减少涡旋（必要时轻轻涡旋）和移液。
• 使细胞保持恒温，因为从低温到高温的变化容易激活细胞[7,8]。
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参考文献：
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