“There are two classes of companies doing cell culture manufacturing, those who have experienced a large scale contamination event and those who will experience a large scale contamination event. ”
—Quote from an experienced cell culture production manager
近年来，由于生物技术的不断发展，越来越多的重组性产品进入临床研究或应用。由于生物制品生产过程中往往涉及到动物源性原辅料，如生产用细胞、培养基、血清、胰酶等，其中潜在的外源性病毒可能导致病毒污染事件发生。如果一个工厂确认了污染事件，或将面临关停、彻底清洁，也会导致药物短缺[1]，造成药厂和患者双方的巨大损失。
图1. 制药过程病毒污染导致的后果
在生物制药中应用最为广泛的是鼠源细胞，比如CHO、NS0及BHK-21等，尤其是CHO细胞，以其作为宿主生产的生物制品约占70%。对于此类细胞来说，容易发生鼠细小病毒（MMV，亦称MVM）污染，而其已经成为危害生物制品安全的一个重要因素。
MMV属于细小病毒科，无包膜，直径约20 nm。基因组为单链DNA，长约5 kb，有四种不同的毒株（i, p, m, c） [2] 。MMV具有极强的稳定性，不易清除和灭活，这也导致了其相对更高的安全风险。有研究显示，MMV在4℃或37℃放置一周，感染滴度下降不超过1.2 log [3] 。
据相关研究，自1985年以来，公开报道或CAACB（生物制造外源污染物研究联盟，Consortium on Adventitious Agent Contamination in Biomanufacturing）收集的数据显示至少发生了26起病毒污染事件[4]（表1）。其中MMV污染发生频率最高（7/26），尤其自2005年以来所占比重更大（5/11），安全风险日益凸显。
表1. 近年来发生过的生物制药生产过程病毒污染事件
Genentech公司曾两次报道以CHO细胞生产的产品由于MMV污染造成巨大经济损失[5] 。
2006年，著名药企Amgen也发生过MMV病毒污染事件，用qPCR方法进行污染源排查，最终把污染源锁定在培养基或细胞收获车间 [6] 。
2009年Merrimack发生的MMV污染事件，通过qPCR方法最终确定培养基添加物为罪魁祸首[7]。
因此， 在生产过程中，各企业都会尽量使用无动物源性原辅料，以尽可能地避免污染的风险。但即便如此，也不能完全避免病毒污染的发生。在一起MMV污染事件中，全程没有使用动物源性原料，但污染却仍然发生了[4]（表2）。
由于野生老鼠也可能感染MMV，并通过粪便、尿液等排泄物污染环境[8]，加之MMV生命力又相当顽强，所以即便使用非动物源性原料，但若仓库中有老鼠活动，也有可能造成生产用原料的MMV污染。由此可见，MMV病毒污染的防控确实是生物制药中需要格外注意的一项工作。
表2. 病毒污染来源
避免病毒污染，应该怎么做
国际上保证产品病毒安全性的主要原则是基于ICH Q5A [9]。为控制生物技术产品的潜在病毒污染，该指南建议采用3种相互联系的原则（图2）。
图2. ICH Q5A病毒控制三原则
工业界使用此方法来保证病毒的安全性非常有效，因此到目前为止仍然保持优良的产品安全记录 [10] 。据统计，迄今为止细胞培养产品病毒污染概率约为0.04% [11] 。在这个过程中，病毒的检测贯穿始终，选择合适的检测方法就显得尤其关键。
很多公司在检测病毒污染的时候会联合应用多种方法以最大限度降低风险[4]（表3）。
表3. 病毒污染检测方法
IVV测试（In-vitro virus test）由于可以检测较多种类的病毒而常被用于cGMP生产的产品放行，而基于PCR技术的检测方法则更为灵敏快速，非常适合用于原辅料及过程样品的监控，尤其像MMV这种高污染风险的病毒。比如CAACB监控到的18起病毒污染，有7起发生在细胞培养阶段，其中有3起是通过PCR检测发现，避免了被污染的细胞向下游转移，减少损失，而在6起下游污染事件中，都没有使用PCR检测 [4] （图3）。
赛默飞能提供什么
针对MMV病毒污染检测，赛默飞专门开发了相应的快速检测试剂盒，灵敏可靠，使用方便。可以实现对整个细胞培养生产过程的实时监控（图4），有助于早期发现污染事件，减少企业损失，降低药物安全风险。
图4. MMV快速检测可对细胞培养生产各阶段实时监控
试剂盒基于PrepSEQ™磁珠法核酸提取和TaqMan®原理qPCR的整合式检测方法，用于在多种样本类型中快速、高灵敏地对潜在病毒进行检测。试剂盒具有以下特点
可检测所有已知MMV毒株（i, p, m, c）
约4小时完成提取和检测
灵敏度可达10 DNA拷贝/反应（相当于0.002 TCID50）
特异性好，鼠、兔、CHO、细菌等无交叉扩增
含可区分的阳性对照，避免由DNA对照导致的假阳性结果
图5.鼠细小病毒MMV提取及检测试剂盒
图6. MMV检测试剂盒高灵敏度和动态检测范围（低至10拷贝/反应）
订购信息
参考文献
1. Anika Manzke and Birte Kleindienst. Virus risk mitigation in cell culture media. BioPharm International, 2016, 29(10): 20-25
2. Mark T. Whary DVM, PhD, DACLAM, Stephen W. Barthold DVM, PhD, Diplomate ACVP, in Laboratory Animal Medicine (Third Edition), 2015
3. 孟淑芳，林林，冯建平等. 鼠细小病毒感染性滴度测定方法的建立及病毒制备。中国生物制品学杂志，2009, 22（8）:815-818
4. Barone, P.W., Wiebe, M.E., Leung, J.C. et al. Viral contamination in biologic manufacture and implications for emerging therapies. Nature Biotechnology (2020)
5. Garnick RL. Experience with viral contamination in cell culture. Dev Biol Stand, 1996,88:49-56
6. Jim Skrine. A biotech production facility contamination case study-minute mouse virus. PDA J Pharm Sci and Tech, 2011, 65:599-611
7. Moody M. et al. mouse minute virus (MMV) contamination-a case study: detection, root cause
8. Werner Nicklas, Michael Mähler, et al. in The Laboratory Mouse (Second Edition), 2012
9. ICH Q5A (R1): Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Geneva, Switzerland, 1999.
10. 陈琪等, 细胞培养生物制品在不同研发阶段病毒清除的要求,中国新药杂志，2014 , 23 ( 8 ):962-967
11. Viral Invaders, Protection at the genetic level-a new line of defense against contamination in biopharmaceutical manufacturing. SAFC Pharma/Biopharma Raw Materials, 2016 EMD Millipore Corporation.
以上内容来源于赛默飞生物工艺
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