器官芯片助力胎盘屏障模型构建及先兆子痫病理研究、药物开发

通过基于基质胶共培养人滋养层细胞系BeWo b30和人脐静脉内皮细胞HUVEC，在3通道芯片中构建了胎盘屏障模型（图1）。

相差图像显示，BeWo b30细胞在培养3天后形成针对胶原I/IV ECM凝胶的上皮屏障，并随着时间的推移向血管通道增殖（图2 A）。BeWo b30与HUVEC共培养（图2 Aii）维持不同的母体和胎儿隔室。通过染色上皮粘附连接区室（ECAD）以及上皮和内皮肌动蛋白来观察区室（图 2B）。胎盘屏障模型的肌动蛋白和紧密连接标记物ZO-1（图 2C）的3D重建显示两个管腔化和可灌注的小管，其顶端和基底侧具有分开的通道。胎盘屏障共培养物在整个芯片上具有高度可重复性（图2D）。在妊娠期间，胎盘屏障厚度已知会降低，在妊娠早期降低到20μm至100μm之间的距离。培养9天后，通过测量上皮细胞和内皮细胞之间的最短、最长和平均距离来评估胎盘屏障芯片培养物的母胎界面距离（图 2E）。对于75%的培养物，获得的最长距离和平均距离分别在51-229μm和9-187μm之间。这些可变距离与孕早期体内情况相当。

（A）（i）BeWo b30单培养物（母体隔室）或（ii）与HUVEC（胎儿隔室）共培养的代表性相差图像，显示从第3天到第9天的细胞培养生长情况。中间通道包含胶原蛋白 I/IV ECM 凝胶。比例尺：200μm。（B）培养9天后胎盘屏障共培养的最大强度z投影。肌动蛋白（绿色）和 DNA（蓝色）染色显示母胎界面，ECAD（红色）染色了不同的母体隔室。（C）胎盘屏障的ZO-1（红色）、肌动蛋白（绿色）和 DNA（蓝色）染色的3维重构，显示近距离的母体和胎儿室管腔化。（D）培养9天后含有胎盘屏障培养物的20个芯片培养室的视图，肌动蛋白染色（黄色）。（E）通过胎盘屏障肌动蛋白免疫染色获得的母胎界面距离定量。

在体内，合胞体是一种极化且分泌的上皮细胞，对妊娠的建立和维持至关重要。通过基因和蛋白质表达分析，在芯片上的胎盘屏障具有此类特征。如培养9天时母体隔室的微绒毛标记物ezrin（图 3Ai）免疫染色为阳性，不同的滋养细胞表达微绒毛蛋白。肌动蛋白和ezrin染色的3D重构（图3Aii）显示形成了一个汇合的滋养层，微绒毛仅在上皮的顶端/管腔侧形成。在基因表达水平上进一步证实了合胞体的形成（图3B）。分化48小时后，BeWo b30显示合胞素-2 mRNA上调，并随着hCG-α和hCG-ß（人绒毛膜促性腺激素的两个亚基）以及胎盘生长因子PlGF基因表达的增加而增加。在蛋白质水平上，上皮细胞的紧密连接（ZO-1）和 DNA标记的染色显示连接在分化时被破坏（图 3C）。如肌动蛋白染色所显示，滋养层汇合在分化时得到维持。此外，与未分化的上皮相比，hCG-ß和ECAD的染色（图3Di）以及hCG-ß强度定量（图3 E）显示模型中激素显着增加，该激素是在合成细胞滋养细胞中特异性产生的（图3 Dii）。此外，虽然在未分化的培养物中，母体室腔内的激素分泌（图3F）重新维持了低而稳定的时间，但在分化时观察到显着的时间依赖性，增加了4.5倍（图3G）。

（A）（i）对Ezrin（红色）和 DNA（蓝色）染色的合胞体微绒毛的最大强度z投影。（ii）对Ezrin（红色）、肌动蛋白（黄色）和 DNA（蓝色）染色的合胞体层进行3维重构，显示极化合胞体。比例尺：50μm（B）滋养层分化标志物Syncytin-2，hCG-α，hCG-ß和PlGF在未分化或分化的BeWo b30中的mRNA表达。（C）未分化和分化的BeWo b30对ZO-1（红色）、肌动蛋白（黄色）和DNA（蓝色）染色的代表性最大强度z投影显示分化时形成多核合胞体。（D）ECAD（绿色）、hCG-ß（红色）和DNA（蓝色）染色的未分化和分化 BeWo b30 的代表性和（i）最大强度z投影。放大图（ii）显示了形成的合胞体内滋养层激素的产生。（E）未分化或分化BeWo b30的 hCG-ß免疫染色的总荧光强度分析。（F）第7天（分化前）、第8天（分化24小时）和第9天（分化48小时）未分化和分化上皮的 hCG-ß 的分泌。（G）在第8天（24小时分化）和第9天（48小时分化）时分化未分化的BeWo b30 管腔中hCG-ß 释放的倍数变化。

为了提供一种跨母胎屏障的转运评估工具，胎盘屏障模型具有类似的基底膜结构，这对过滤、屏障完整性和药物转运活性至关重要。为了验证基底膜分子组成，对合胞体和内皮细胞进行了不同的膜蛋白染色（图4A）。母体和胎儿分泌层粘连蛋白和基底膜蛋白多糖（perlecan）（图4Ai），胶原蛋白IV（图4Aii）和巢原蛋白-2（nidogen）（图4Aiii）。相反，只有内皮细胞产生纤连蛋白（图4Aii），而腱生蛋白（tenascin-C）仅由合胞体分泌（图4Aiii）。合胞体是溶质细胞旁转运的主要物理屏障。为了表征我们模型中的合胞体屏障密封性，将荧光 4.4 kDa TRITC标记的葡聚糖加入到滋养层管腔（图 4B）。在培养 7、8 和 9 天时，对未分化和分化的滋养层小管从管腔渗漏到相邻凝胶室进行监测。未分化和分化的上皮细胞都形成了一个随时间推移而稳定的密封屏障（图 4C）。在培养9天时，与 4.4 kDa TRITC标记的葡聚糖相比，荧光素细胞旁转运增加了38.5%（图 4D）。跨上皮电阻（TEER）（图 4E）显示，未分化的上皮屏障随着时间的推移增加了其紧密性，而滋养层上皮在分化时表现出时间依赖性下降。在整个妊娠期间，胎盘中的药物转运蛋白会保护胎儿免受外源性物质的侵害。因此，我们在胎盘模型中证明了多重耐药蛋白（MRP）的功能。在培养的第9天，使用 MK571 和槲皮素（两种MRP抑制剂）评估MRP介导的转运。在母体（图4 F，G）和胎儿（图4 H，I）隔室中存在MK571和槲皮素的情况下，细胞内荧光强度呈剂量依赖性增加，表明MRP介导的外排转运在合胞体和内皮细胞中均受到抑制。

（A）对DNA（蓝色）和基底膜蛋白（i）层粘连蛋白（绿色）和基底膜蛋白多糖（红色）、（ii）胶原蛋白IV（绿色）和纤连蛋白（红色）、（iii）巢原蛋白-2（绿色）和腱生蛋白-C（红色）染色的合胞体和内皮细胞的最大强度z投影。（B）在第7，8和9天使用4.4kDa TRITC-葡聚糖在母体隔室中用荧光分子（红色）灌注12分钟，滋养层在分化条件下于第7天开始分化。无细胞对照显示荧光染料进入相邻的凝胶和灌注通道，而模型中荧光染料则被未分化和分化的滋养层小管截留。（C）在第 7、8和9天，T=12分钟后，母体管基底侧4.4 kDa TRITC-葡聚糖强度与母体管顶端强度之比（渗漏评分）。（D）在T=12分钟后培养9天后分化的滋养细胞中，母体管基底侧4.4 kDa TRITC-葡聚糖和荧光素（0.376 kDa）强度与母体管顶端强度的比值（渗漏评分）。（E）在第 6、7、8 和 9 天在未分化和分化的滋养层上测量的跨上皮电阻。第7天滋养层开始分化。（F）-（I）胎盘屏障中多重耐药蛋白（MRP）转运蛋白活性的评估。采用非荧光CMFDA作为MRP底物。被动进入细胞，并在细胞内转化为其荧光产物MF-SG。（F）&（H）用载体（DMSO）或两种MRP特异性抑制剂MK571（5μM，10μM，30μM）和槲皮素（30μM）处理30分钟的分化滋养细胞（F）和内皮细胞内GS-MF（绿色）最大强度z投影。

缺氧和缺血是胎盘损伤的主要原因，可诱发先兆子痫、宫内生长受限和妊娠高血压。为了在胎盘屏障模型中模拟与子宫胎盘缺氧病理相关的特征，将培养物暴露于不同的氧气和灌注强度条件。模拟健康条件的参数包括20% O2和灌注流量，此处称为“常氧”条件（图 5Ai）。通过在第8天将培养物切换到1% O2和灌流24小时（“缺氧”）或1% O2和静态培养基条件（“缺血”）来模拟病变环境。在不同氧张力和灌注速率下培养的胎盘屏障的相差图像未显示培养物生长和稳定性的变化（图5B）。然而，在第8天和第9天通过合胞体的跨上皮电阻（TEER）（图 5C）表明，“缺血”环境触发了合胞体内嵌损伤。事实上，虽然“常氧”和“缺氧”条件都显示TEER值随时间分别下降1.23倍和1.29 倍，表明缺氧本身并不影响上皮屏障，但“缺血”条件引发了合胞体通透性显着下降1.9倍。与“常氧”条件相比，“缺血”条件下的合胞体区域细胞增加了10%（图5 D，E）。在基因表达水平（图5F）上表征不同的合胞体，以寻找已知在胎盘病理学中失调的标志物。与融合标记物“常氧”模型相比，合胞素-2在“缺氧”中表现出1.58倍的减少，在“等氧”条件下表现出0.58倍的变化。同样，在“缺氧”条件下，两种人绒毛膜促性腺激素亚型hCG-α和hCG-β的mRNA水平下调幅度更大，分别变化1.52倍和2.13倍，而“缺氧”条件下的变化分别为1.04倍和1.57倍。最后，胎盘生长因子PlGF，子痫前期的一种决定性生物标志物，在低氧张力下表达也降低 1.81倍，而暴露于缺氧缺血环境后，其表达降低至1.48倍。

在蛋白质水平上进一步检测合胞体的变化。微绒毛标记物Ezrin（图5 G）的免疫染色显示与“常氧”胎盘模型相比，“缺氧”条件适度增加，但无统计学意义（图5 H）。然而，“缺血”条件的 Ezrin 表达比“常氧”胎盘模型低 50%。与“常氧”条件相比，hCG-β的信号（图5 I，J）在“缺氧”条件下降低。通过测量暴露于不同氧/灌注环境之前和之后24小时后释放到合胞体腔中的激素水平，在分泌水平上证实了hCG-β的降低（图 5K）。事实上，虽然激素分泌在“常氧”胎盘模型中增加了 3.06 倍，但在“缺氧”和“缺血”中分别只观察到 1.84 倍和 1.67 倍。综上所述，缺氧本身或与静态缺血条件相结合可以诱导胎盘屏障表型变化。

(A)模拟健康和先兆子痫条件参数流程。第8天，胎盘屏障模型(i)保持在标准条件下:20%的氧气和流量(“常氧”)，(ii)在1%的氧气和流量下培养24小时(“缺氧”)，或(iii)在1%的氧气和静态(“缺血”)下培养24小时。(B)胎盘屏障模型的代表性相衬图像，培养8天和9天的(i)“常氧”、(ii)“缺氧”和(iii)“缺血”状况。(C)在“常氧”、“缺氧”和“缺血”条件下，合胞体第9天的经上皮电阻(TEER)值与第8天相比发生了翻倍变化。(D)培养9天后，在“常氧”、“缺氧”和“缺血”条件下合胞体核计数的代表性汇z投影。(E)“正常”、“缺氧”和“缺血”状态下细胞核计数的定量。(F)“常氧”、“缺氧”和“缺血”状态下滋养细胞分化标志物Syncytin-2、hCG- α、hCG-ß和PlGF的mRNA表达。(G)“常氧”、“缺氧”和“缺血”状态下Ezrin强度的代表性z投影。标尺:50 μm。(H)在“常氧”、“缺氧”和“缺血”条件下，Ezrin强度与合胞体核数之比。(I)“常氧”、“缺氧”和“缺血”状态下hCG-ß强度的代表性z投影。标尺:50 μm。(J)在“常氧”、“缺氧”和“缺血”条件下合胞体中hCG-ß强度与核数之比。(K)在“常氧”、“缺氧”和“缺血”条件下，第9天和第8天母体房室腔内hCG-ß的分泌量的变化。

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