BHK-21细胞系是来源于幼年叙利亚地鼠肾（Baby Hamster Syrian Kidney）细胞系，其细胞增殖能力强，环境适应性高，是最容易培养的动物细胞类型之一。BHK-21细胞系已被广泛应用于多种病毒的增殖，以生产兽用疫苗[1, 2]。
原始的BHK-21细胞株是贴壁依赖性的成纤维细胞，1962年经Capstick等人的驯化实现了悬浮培养[3]。悬浮培养系统相较于传统的贴壁培养系统，具有细胞增殖快、培养环境均一、操作简单可控、放大方便、污染率低、成本可控等优点，是更为理想的大规模生产方式。
传统的BHK-21细胞培养基多需配合较高含量的血清使用，以保持细胞良好的生长状态。然而血清成分复杂，会影响不同批次细胞之间的稳定性，同时也增加了生产成本。随着近年来对于血清成分和性能的研究，人们逐渐开始用化学成分明确的营养物质取代血清中的成分，开发出了多种低血清和无血清培养基。
康宁BHK-21无血清培养基（BHK-21 Serum-Free Medium, SFM）和BHK-21减血清培养基（BHK-21 Serum-Reduced Medium, SRM）是针对BHK-21细胞开发的细胞悬浮培养基。经过检测，康宁BHK-21 SFM和康宁BHK-21 SRM能有效降低BHK-21细胞对于血清的依赖，且细胞在培养基中易于驯化、增殖速度快、代次间稳定性强。
在本研究中，我们将具体展示康宁BHK-21 SFM和康宁BHK-21 SRM对于BHK-21细胞生长的支持，并从细胞的驯化难易程度、细胞扩大培养状态、培养基对细胞最大扩增能力的支持等多个角度，与对照品牌的BHK-21无血清或低血清悬浮培养基进行比较。
材料与方法
本研究使用的BHK-21细胞来自ATCC,Cat.No.CCL-10™
取液氮冻存细胞快速溶解于37℃水浴中，将融化后的冻存细胞悬液（1ml）转移至15ml离心管中，添加5倍冻存细胞悬液体积（5ml）的新鲜康宁BHK-21 SFM康宁BHK-21 SFM（Corning, Cat. No. 90-101），缓慢充分混匀后，300g离心5分钟，弃上清，加入适量新鲜康宁BHK-21 SFM重悬细胞。对重悬的BHK-21细胞进行计数后，调整至所需细胞密度接种于125ml 锥形培养瓶中，添加新鲜康宁BHK-21 SFM培养基至30ml。将细胞置于37℃、5% CO2、110rpm的环境中培养。
挑选细胞形态良好，且生长旺盛的细胞进行驯化，以确保驯化的顺利进行。本次研究中所采用的驯化方案为：将成功复苏且生长状态良好的BHK-21细胞，以4×105 cells/ml的密度接种于125ml 锥形培养瓶中，分别在康宁BHK-21 SFMBHK-21 SFM（Corning, Cat. No. 90-101）、康宁BHK-21SRMBHK-21 SRM（Corning, Cat. No. 90-104）及对照品牌的BHK-21细胞无血清或低血清悬浮培养基中持续培养2天，然后调整细胞密度进行传代，以此方法共进行3次连续传代。记录细胞在不同品牌的BHK-21细胞悬浮培养基中的扩增倍数与倍增时间，以确定驯化是否成功并对比不同品牌悬浮培养基驯化BHK-21细胞的难易程度。
将在不同品牌悬浮培养基中驯化好的BHK-21细胞以5×105 cells/ml的密度依次接种在125ml、250ml、1000ml 锥形培养瓶中，进行逐级放大培养，每代培养周期为2天。记录细胞的扩增倍数、倍增时间与细胞代次间的稳定性，以对比BHK-21细胞在不同品牌悬浮培养基中进行扩大培养时细胞的生长情况。
将在不同品牌悬浮培养基中驯化好的BHK-21细胞以5×105 cells/ml的密度接种在125ml 锥形培养瓶中，在不同品牌悬浮培养基中持续培养4天，记录细胞到达最高密度的时间与产量，并观测在此过程中细胞活率的变化，以对比不同品牌的悬浮培养基对BHK-21细胞极限生长的支持。
结 果
将成功复苏且生长状态良好的BHK-21细胞，以4×105 cells/ml的密度接种于125ml 锥形培养瓶中，分别在不同品牌的BHK-21细胞悬浮培养基中持续培养2天，然后调整细胞密度进行传代，以此方法共进行3次传代。
图1. 不同品牌悬浮培养基对BHK-21细胞驯化能力检测。A. 连续传代过程中细胞产量检测；B. 连续传代过程中细胞扩增倍数检测；C. 连续传代过程中细胞倍增时间检测。
结果如图1所示，BHK-21细胞能够直接适应康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM，在连续三代的传代培养中，始终保持了高速生长与稳定的增长倍数，且BHK-21细胞在康宁悬浮培养基中的生长速度要高于其他品牌的悬浮培养基。这一结果体现出BHK-21细胞非常易于在康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM中驯化，并迅速维持住良好的生长状态，有助于大规模生产使用。
将在不同品牌悬浮培养基中驯化好的BHK-21细胞以5×105cells/ml的密度依次接种在125ml、250ml、1000ml锥形培养瓶中，进行逐级放大培养，每代培养周期为2天。
图2.不同品牌悬浮培养基对BHK-21细胞扩大培养能力检测。A. 连续逐级放大培养过程中细胞产量检测；B.连续逐级放大培养过程中细胞扩增倍数检测；C. 连续逐级放大培养过程中细胞倍增时间检测。
结果如图2所示，BHK-21细胞在康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM中的生长速率均高于绝大多数其他品牌的悬浮培养基，只有在1000ml锥形培养瓶中时，Brand-G的培养基中BHK-21细胞的生长速度略高于康宁的两款培养基。但康宁的两款培养基在不同规格的锥形培养瓶中生长速度保持了非常稳定的水平。
快速且稳定地支持细胞增长很好的体现出了康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM在BHK-21细胞扩大培养过程中的优势。
此检验旨在检测各品牌无血清或低血清悬浮培养基对于BHK-21细胞最大生长密度的支持，以便在实际应用过程中，为实验者提示细胞最佳生长状态的节点，有助于快速优化实验方案。
将在不同品牌悬浮培养基中驯化好的BHK-21细胞以5×105 cells/ml的密度接种在125ml 锥形培养瓶中，分别在不同品牌悬浮培养基中持续培养4天。
图3. 不同品牌悬浮培养基BHK-21细胞扩增能力检测。A. 连续培养4天细胞产量检测；B. 各品牌悬浮培养基最大细胞扩增倍数；C. 连续培养4天细胞活率检测。
结果如图3所示，BHK-21细胞在所有品牌的悬浮培养基中，都在第3天达到增长峰值，此后细胞数与细胞活率都会开始下降。从所能支持的细胞最大扩增倍数来看，康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM表现要好于其他品牌的悬浮培养基。
这一结果说明康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM在支持BHK-21细胞培养的极限状态下，依然保持了很高的水平。同时，BHK-21细胞在悬浮培养基中的扩增能力的检测也有助于实验者选取最佳细胞生长状态，优化实验方案。
结 论
BHK-21细胞可以直接在康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM中生长，无需过多驯化步骤，且细胞生长状态良好。
康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM在BHK-21细胞的扩大培养过程中，细胞扩增速度明显快于其他品牌的悬浮培养基，且细胞在不同规格的锥形培养瓶中表现稳定。
康宁BHK-21 SFM与康宁BHK-21 SRM能够支持BHK-21细胞最大连续3天的扩增生长，与其他品牌悬浮培养基相同，但是细胞的最大扩增倍数，康宁的两款培养基要明显高于其他品牌的培养基。
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