华南师范大学刘有胜团队JHM|蛋白核小球藻共代谢降解诺氟沙星:碳源影响、生物转化机制和关键驱动基因

文摘   2025-01-06 21:00   北京  

文章信息

第一作者:吴亨宇

通讯作者:刘有胜 教授,熊倩 副研究员
通讯单位:华南师范大学,中国水产科学研究院南海水产研究所

https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.136971

亮点

• 浓度为10  mmol/L的葡萄糖显著增强了诺氟沙星的去除。
• 葡萄糖显著提高了微藻生物量、过氧化物酶活性和胞外蛋白含量。
• 生物降解是诺氟沙星去除的主要机制,同时在微藻细胞内检测到氟元素
• 通过UPLC-QTOF-MS鉴定来源于I相和II相反应的8主要代谢产物。
• 与细胞色素P450酶系、过氧化物酶和谷胱甘肽相关的基因是NFX共代谢中的关键驱动因素。

摘要

大量研究证明添加合适的碳源构建共代谢体系,可以显著提高微藻对广泛存在且难降解的微污染物的去除效率。然而,碳源对微藻共代谢降解转化抗生素的影响机制尚不清楚。本研究结合抗生素降解转化产物的动态变化以及转录组学、基因网络分析、胞外聚合物(EPS)及酶活性分析,深入探究蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)介导的诺氟沙星(NFX)共代谢降解转化生物学机制。研究结果表明,葡萄糖、甘氨酸、乙酸钠和碳酸钠均显著提高了NFX的去除效率,其中10 mmol/L葡萄糖效果最佳,去除效率达61.5%。葡萄糖的加入显著增加了微藻的生物量、过氧化物酶活性及胞外蛋白分泌,从而加速了NFX的降解。质量平衡分析表明,生物转化是NFX去除的主要机制,这一结论得到了微藻细胞内检测到氟元素的支撑。通过UPLC-QTOF-MS鉴定到涉及脱氟、哌嗪环转化、脱羧、乙酰化及氧化等反应的8种主要代谢产物。结合NFX降解转化产物的质谱数据及其动态变化规律,提出NFX可能的降解转化路径。基因水平,4种碳源对C. pyrenoidosa转录组产生了显著影响。差异表达基因分析表明,这些碳源显著影响了与细胞色素P450酶家族(CYP450)、谷胱甘肽(GSH)和过氧化物酶(POD)相关的基因,这些基因在NFX的共代谢降解转化的过程中起到了重要作用。本研究为碳源对微藻共代谢降解NFX的特定影响提供了独特的见解,揭示了微藻共代谢降解NFX的关键基因和潜在的生物学机制(图1)。

图1 图文摘要

研究结果

1 NFX降解转化动力学

不同碳源条件下NFX的降解动力学如图2所示。经过7天培养,无碳源对照组中NFX的降解率为30.8%;当葡萄糖添加浓度为1、10和20 mmol/L时,NFX的降解率对应为40.5%、61.5%和59.5%(图2a);当乙酸钠添加浓度为1、10和20 mmol/L时,NFX的降解率对应为35.4%、41.1%和38.6%(图2b);当碳酸钠添加浓度为1、10和20 mmol/L时,NFX的降解率对应为33.6%、15.0%和12.3%(图2c);当甘氨酸添加浓度为1、10和20 mmol/L时,对NFX的降解率对应为42.4%、59.4和55.7%(图2d)。4种碳源均能促进NFX的降解,促进作用大小依次为葡萄糖>甘氨酸>乙酸钠>碳酸钠。当碳源浓度由1 mmol/L升高至10 mmol/L时NFX的降解率提高(碳酸钠除外),但当碳源浓度继续升高至20 mmol/L时NFX的降解率呈降低趋势。本研究发现,C. pyrenoidosa介导的NFX降解以葡萄糖为最佳碳源,且最佳添加浓度为10 mmol/L。
图2 不同碳源条件下诺氟沙星(NFX,0.5 mg/L)的降解转化动力学

a)葡萄糖;b)乙酸钠;c)碳酸钠;d)甘氨酸;对照组:CK1:仅含0.5 mg/L NFX和小球藻的生物对照组,无额外添加碳源;CK2:仅含0.5 mg/L NFX,无小球藻的非生物对照组(光照);CK3:仅含0.5 mg/L NFX,无小球藻的非生物对照组(黑暗)。

2 碳源对微藻应激氧化酶和胞外聚合物的影响

如图3所示,不同碳源对C. pyrenoidosa应激氧化酶和EPS的含量具有显著影响。谷胱甘肽(GSH)作为抗氧化能力的重要指示剂,在缓解氧化应激和提高细胞抵抗力方面起关键作用。研究发现,葡萄糖和乙酸钠处理组显著提升了GSH水平,而碳酸钠和甘氨酸处理组则有所降低(图3b),表明葡萄糖和乙酸钠在增强C. pyrenoidosa抗氧化能力方面效果较为突出。过氧化物酶(POD)通过利用H2O2参与NFX降解,同时减轻共代谢过程中细胞的应激反应。研究显示,不同碳源显著影响POD活性,其中葡萄糖处理组的POD活性最高,相较对照组提升了10.80倍,显著加速了NFX的降解(图3d)。此外,EPS在缓解细胞压力和提高降解效率中扮演了关键角色,大多数碳源促进了EPS蛋白的生产,尤其是葡萄糖和甘氨酸处理组的EPS蛋白含量显著高于其他组(图3e);而乙酸钠是唯一显著促进EPS多糖生产的碳源(图3f)。EPS蛋白的增加与NFX的去除效率呈一致性,表明其在共代谢过程中至关重要。

图3 碳源(10 mmol/L)对C. pyrenoidosa应激氧化酶和胞外聚合物的影响

a)丙二醛;b)谷胱甘肽;c)超氧化物歧化酶;d)过氧化物酶;e)胞外蛋白;f)胞外多糖。CK1:空白对照组,含有0.5 mg/L的诺氟沙星(NFX)和小球藻,但未添加额外的碳源。
3 NFX降解转化机制

随后采用LC-MS对藻细胞外吸附和藻细胞内累积的NFX浓度进行分析,结果如表1所示。NFX降解过程中,非生物作用所占的比例为0.92%,非生物作用占比低,说明本实验中NFX的降解以C. pyrenoidosa介导的生物作用为主导。另外,所有处理组生物吸附和生物累积占比均较低,因此认为生物转化是C. pyrenoidosa降解NFX的主要机制。进一步,利用X射线能谱仪分析NFX在微藻细胞中的分布情况。微藻中F元素的质量百分比和原子百分比如表2所示。在不添加NFX的空白对照组中,微藻细胞内均未检出元素F,说明正常情况下,微藻细胞内不存在F元素。而NFX降解实验组中,观察到F元素存在于细胞壁和细胞内部,表明吸附于微藻表面的部分NFX进入藻细胞内。微藻对NFX的去除机制可简单概括为3步:1)NFX首先通过生物吸附作用吸附于藻细胞壁;2)随后,藻细胞通过动扩散、被动促进扩散和主动摄取等途径将NFX吸收进入藻细胞内部,并在细胞内部开始累积;3)进入藻细胞内的部分抗生素可通过酶促反应降解。

表1 NFX降解质量平衡

2 微藻中F元素的质量百分比和原子百分比

4 NFX降解转化产物鉴定及路径推导

本研究采用UPLC-QTOF-MS重点分析NFX在最佳碳源条件的降解转化产物。根据精确的质荷比(m/z)以及保留时间(RT)初步确定NFX的可能降解转化产物,随后根据可能的分子式和特征碎片离子进一步确定其化学结构。总共鉴定到涉及脱氟、哌嗪环转化、脱羧、乙酰化和氧化等多种反应的8种主要代谢产物(TPs)(图4)。如图4所示,在代谢途径A中,NFX通过脱氟反应转化为TP1m/z=300.1347,C16H19N3O3),随后通过哌嗪环的去除形成TP2m/z=233.0917,C12H12N2O3)。在代谢途径B中,喹诺酮环上的–C2H5基团被氧化为C2H3O,生成TP3m/z=392.1268,C16H16FN3O4)。在代谢途径C中,哌嗪环部分和完全去烷基化分别生成TP4m/z=294.1251,C12H11FN2O3)和TP5m/z=251.0827,C12H11FN2O3)。随后,TP5进一步氧化生成TP6m/z=251.0467,C11H7FN2O4)。在代谢途径D中,NFX通过脱羧反应生成TP7m/z=276.1509,C15H18FN3O)。在代谢途径E中,TP8m/z=362.1513,C18H20FN3O4)被鉴定为N-乙酰诺氟沙星,是C. pyrenoidosa共代谢降解NFX产生的主要产物。乙酰化是NFX生物降解的常见反应,此前已在真菌 Pestalotiopsis guepini和活性污泥中有所报道。

图4 C. pyrenoidosa介导的NFX共代谢降解转化路径
5 NFX降解的关键基因识别

基于已筛获的NFX共代谢相关的差异表达基因(DEGs),本研究通过网络分析进一步识别驱动C. pyrenoidosa共代谢降解转化NFX的关键基因。重点分析了CYP450酶、POD和GSH代谢相关的DEGs,共表达相关性分析结果见图5。在葡萄糖处理组中,NFX降解相关的关键功能基因包括编码CYP450酶的基因(如CYP97C1CYP97B3),POD相关基因(如PRXQPRDX2E1.11.1.11PRDX3),以及谷胱甘肽代谢相关基因(如GSTPRP-S16GLRX2)(图5a)。在乙酸钠处理组中,与NFX共代谢相关的重要基因包括与GSH代谢相关的RRM2GSTPGST基因,与POD相关的E1.11.1.11PRXQ基因,以及CYP450酶家族相关的CYP97B3基因(图5b)。在碳酸钠处理组中,观察到的相关基因较少,其中CYP97C1被鉴定为关键的CYP450基因,gpxPRXQ是与POD相关的主要基因,而DPH5、GSTPVARS与GSH代谢相关(图5c)。在甘氨酸处理组中,NFX共代谢的关键功能基因包括与POD相关的CcPPRXQ,与GSH代谢相关的GLRX2GSTPtehA,以及编码CYP450酶家族成员的CYP97C1CYP55(图5d)。网络分析证实了这些基因在C. pyrenoidosa共代谢降解NFX过程中的关键作用,为进一步揭示C. pyrenoidosa共代谢降解NFX的生物学机制提供了重要依据。

图5 不同碳源处理组差异表达基因网络分析

蓝色圆圈表示与谷胱甘肽代谢相关的基因,红色圆圈表示与过氧化物酶(POD)相关的基因,紫色圆圈表示与CYP450酶家族相关的基因。

主要结论

本研究表明,添加合适的碳源作为C. pyrenoidosa共代谢降解转化NFX的生长基质,可以显著提高NFX的去除效率。其中,葡萄糖的加入显著增强了POD的活性,促进了EPS中蛋白质的分泌,从而有效提高了NFX的去除效率。NFX去除的主要机制为生物转化,通过脱氟、哌嗪环转化、脱羧、乙酰化和氧化反应生成了8种主要代谢产物。转录组学分析及基因网络分析表明,与CYP450酶家族、GSH及过POD相关的基因在NFX的共代谢过程中起重要作用,这些酶可能是C. pyrenoidosa共代谢降解转化NFX的关键驱动因素。本研究从微藻表型变化深入到分子水平,系统揭示了碳源对微藻共代谢降解抗生素的影响机制。相关研究结果强调了微藻介导的抗生素去除技术在水环境污染治理方面的潜在用途,这对于保护水生生态系统和公众健康免受抗生素相关风险的影响具有重要意义。

作者介绍


刘有胜,教授,博导,华南师范大学环境学院院长助理、广东省化学品污染与环境安全重点实验室副主任、第四届《生态毒理学报》编辑委员会委员。2012-2017年,中国科学院广州地球化学研究所有机地球化学国家重点实验室副研究员。主要从事新污染物环境行为、降解转化及风险评价研究;主持和参加了国家基金重点/联合基金/面上/青年基金、国家水专项东江项目、科技部重点研发计划课题、广东省重点研发和面上课题等项目20余项;发表了SCI论文180余篇,其中3篇为高被引论文;SCI论文总他引11000余次,h-index 53,连续5年入选World’s Top 2% Scientists(2020年、2021年、2022年、2023年和2024年)。编制抗生素检测方法团体标准2项,授权专利5项、软件著作权5项;获得了环境保护部科技成果奖(2017)和中国科学院院长优秀奖(2012年)等奖项。

通讯邮箱yousheng.liu@m.scnu.edu.cn


熊倩,副研究员,硕导,博士毕业于中国科学院广州地球化学研究所。2020-2022年,华南师范大学博士后;出站后,入职中国水产科学研究院南海水产研究所;主要从事环境新兴有机污染物的生态毒理效应、生物降解转化及归趋等方面的研究。主持国家自然科学基金青年基金、中国博士后科学基金面上项目、广东省自然科学基金面上项目、广东省基础与应用基础研究基金省市联合基金区域联合基金-青年基金项目、广东省青年优秀科研人才国际培养计划博士后项目、广州市科技计划项目、海南省自然科学基金面上项目等。已在Water ResearchEnvironment InternationalEnvironmental Pollution等发表SCI论文20余篇。

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