【华西耳鼻喉学术前沿速递】非小细胞肺癌的单细胞和空间转录组学分析-第42期

为了确定肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）中免疫和非免疫细胞状态的异质性及其空间景观，研究者收集了25名未经治疗的LUAD（n =13）、LUSC（n =8）或未确定的肺癌（LC，n =4）患者和两名健康死亡捐赠者的肺组织切除物（图1A、B）。收集了肿瘤和匹配的正常非致瘤组织（这里命名为“background”）、分离CD45+免疫细胞和其他非免疫细胞群体，并进行了scRNA-seq测序。此外，使用10x Genomics Visium 平台对上述25名患者中的8名患者的肿瘤和背景组织切片进行空间转录组学处理（ 共n=36个切片）（图1A）。

图1 单细胞转录组学揭示NSCLC的异质性。

研究鉴定出具有单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）以及肥大细胞、自然杀伤（NK）细胞、T细胞、B细胞和非免疫细胞转录特征的髓样细胞簇（图1C、D），并确定了一个以髓系基因（LYZ、CD68、CD14、MRC1）和上皮基因（KRT19、EPCAM）共表达为特征的簇（图1D-F）。这些细胞存在于肿瘤内，与之前描述的癌症相关巨噬细胞样细胞（CAML）相似。CAML代表一类独特的大型髓系细胞，同时伴有上皮肿瘤蛋白的表达。这些独特的细胞已在患有各种恶性肿瘤（包括NSCLC）的患者的血液样本中观察到。CAML的丰度与治疗干预的反应呈直接相关性，这突显了它们的功能重要性。在进一步细分亚群后，CAML仍保持其独特的双重髓系上皮特征。值得注意的是，双联体检测软件Scrublet为CAML分配了较低的双联体分数，这表明它们的表达谱不太可能被解释为由肿瘤细胞和巨噬细胞测序产生的组合特征。

在肿瘤中，研究检测到成纤维细胞和淋巴管内皮细胞（LEC）比例的减少。此外，上皮细胞群表现出更高的多样性，存在肺泡II型（AT2）、下调上皮标志物（KRT19、EPCAM、CDH1）的非典型上皮细胞、上调髓系标志物（LYZ）的过渡上皮细胞和肿瘤组织中的循环上皮细胞（图1G）。这些差异与肿瘤标本中上皮细胞可能是突变肿瘤和非突变正常细胞的混合物这一事实一致，并表明肿瘤转化导致细胞状态进一步多样化。

与背景相比，肿瘤样本中单核细胞和未成熟髓系细胞的比例显著降低，而树突状细胞和B细胞在总体上扩增。为了进一步了解肿瘤与背景组织的细胞组成，研究者对每个大簇进行了亚聚类，并确定了46种细胞类型/状态。结果发现与背景相比，肿瘤中NK细胞的比例显著更高，但细胞毒性表型较低。最后，研究者发现抗炎Mɸ（AIMɸ）的异质性和比例增加，其中循环抗炎Mɸ、STAB1 +Mɸ（图1I）和CAML（图1H）在肿瘤组织中大量存在。有趣的是，研究发现STAB1+Mɸ/AIMɸ和T/NK细胞的频率在患者中呈强烈的负相关性，凸显了Mɸ在抑制肺癌肿瘤组织中细胞毒性细胞浸润方面的关键作用（图2A）。这与最近一项研究的描述一致：人类NSCLC中单核细胞衍生的Mɸ获得免疫抑制表型并抑制NK细胞的浸润。

图2 综合单细胞和空间转录组学揭示了 LUAD 和 LUSC 中的不同相互作用网络。

LUAD和LUSC的预后非常不同，通常被视为不同的临床实体。为了探索临床特征的差异是否源于不同的细胞组成，研究者比较了LUAD与LUSC患者中免疫和非免疫细胞亚群的频率。他们观察到两种亚型细胞组成频率差异很小，在P值校正后未达到统计学意义。此外，在患者中观察到的免疫和非免疫细胞的频率与癌症亚型、癌症分期或性别之间没有明显关联，这表明LUAD和LUSC中的TME组成非常相似。虽然LUAD和LUSC具有相似的细胞组成，但观察到的临床区别可能来自不同的细胞间相互作用。因此，研究者再次检查了LUAD与LUSC的TME中是否采用了不同的细胞间相互作用网络。使用CellPhoneDB推断出在背景中未检测到的具有统计学意义的配体-受体对（L-R）及其相应的细胞类型，从而确定了每种肿瘤亚型中特异性的细胞-细胞相互作用。虽然两种肿瘤亚型显示出相似的相互作用网络，主要涉及非免疫细胞、AIMɸ和T细胞之间的相互作用（图2B），但也存在一些显著差异。

研究发现，几对免疫检查点抑制剂（ICI）及其各自的抑制分子在LUAD和LUSC中存在差异共表达（图2C、D）。例如，在LUAD中经常发现LGALS9-HAVCR2（TIM3）、NECTIN2-CD226（DNAM1）和NECTIN2/NECTIN3-TIGIT，而CD96-NECTIN1则优先出现在LUSC中（图2C、D）。相反，在两种肿瘤亚型中均发现了CD80/CD86-CTLA4和HLAF-LILRB1/2（图2C、D）。LILRB（白细胞Ig样受体）正在成为下一代免疫治疗的潜在靶点，因为阻断它们可以增强免疫反应。最常用的肺癌免疫疗法阻断了PD1和PDL1之间的相互作用，然而在此项数据集中，并没有观察到任何一种肿瘤亚型中的PD1-PDL1相互作用（图2C、D）。初步分析表明其他ICI（如 CTLA4、TIGIT、LILRB1/2和TIM3）可能是治疗NSCLC的有希望的靶点。

在LUAD和LUSC中检测到的显著L-R中，研究者注意到不同髓系细胞群中有几对L-R参与血管生成信号传导，例如VEGFA/B-FLT1、VEGFA-KDR和VEGFA-NRP1/2。尽管发现VEGFA和VEGFB在LUAD和LUSC中都有表达，但它们的受体在LUAD中更常见，尤其是在成纤维细胞中（图2E）。同样，研究发现AT2和循环上皮细胞中EGFR配体信号的显著表达，例如EGFR-EREG、EGFR-AREG、EGFR-HBEGF和EGFR-MIF，尽管MIF在LUSC的细胞中表达更多（图2F）。最后，研究还观察到了支持淋巴细胞活化所需的关键共刺激信号，例如CD40-CD40LG、CD2-CD58、CD28-CD86、CCL21-CCR7和TNFRSF13B/C-TNFSF13B（TACI/BAFFR-BAFF），这些信号通常与主要由B细胞、T细胞和DC组成的异位淋巴器官即三级淋巴结构（TLS）的存在有关。TLS通常与NSCLC中较长的无复发生存期相关。

CellPhoneDB基于scRNA-seq数据集中不同细胞类型簇中基因的共表达，可以计算出显著的L-R及其相互作用的细胞类型。然而，为了辨别生物学上显著的相互作用，我们必须确定被识别为相互作用的细胞类型是否在物理上位于同一位置。为此，研究者检查了scRNA-seq识别的细胞类型在组织切片上的空间排列方式。这里，研究采用了一种综合方法，将肿瘤和背景样本的scRNA-seq与新鲜冷冻肿瘤和背景组织切片的空间转录组（STx）谱相结合，对8名患者的两个连续的10µm切片进行了10×Visium，其中7名患者的样本与scRNA-seq的样本相匹配。接下来，研究使用cell2location和来自scRNA-seq数据集的细胞类型特异性表达谱来反卷积组织切片上的细胞类型丰度（图3A）。

图3 10x Visium证实了关键配体-受体对的空间共定位。

在组织切片上确定细胞类型后，研究者检查了肿瘤和背景组织所有切片中不同细胞类型的频率。分析证实，肿瘤和背景中所有切片中细胞类型频率的差异与scRNA-seq数据中获得的结果一致（图3B）。

接下来，研究者检查了cellphoneDB识别的L-R的空间共定位，使用χ2检验比较了匹配的肿瘤切片与背景切片中L-R基因共定位与非共定位的点的频率。由于从LUSC和LUAD患者中采集的组织块数量较少（LUSC =3，LUAD=5），统计功效不足以对LUAD/LUSC特异性L-R的空间定位进行比较分析。尽管如此，研究仍然证实了上述几种肿瘤特异性L–R在肿瘤中的共定位明显高于在背景切片中的共定位，包括NRP1-VEGFA和NECTIN2-TIGIT、LGALS9-HAVCR2和CD96-NECTIN1（图3C-E）。另外，与cellphoneDB结果一致，研究在肿瘤切片中没有发现PD1-PDL1的明显共定位。

手术切除的肿瘤样本包含恶性上皮细胞和残留的正常上皮细胞。人类肿瘤单细胞测序的一个重大挑战在于区分癌细胞和非恶性细胞。因此，研究者应用肿瘤拷贝数核型分析（CopyKAT）来辨别单个细胞内的全基因组非整倍体。由于非整倍体在人类癌症中很常见，因此具有全基因组CNA的细胞被视为肿瘤细胞。

使用CopyKAT进行的分析显示，肿瘤组织中存在大量患者特异性CNA（图4A），但在背景中没有。在单个肿瘤样本中，在AT2和循环AT2细胞中检测到CNA，在一些患者中，这些基因改变在AT2/循环AT2细胞和非典型上皮细胞之间是共享的，表明不同上皮亚群之间存在密切的谱系关系（图4A）。通过PAGA推断肿瘤中非血细胞群的轨迹证实了这一发现：PAGA显示一侧的AT2细胞、循环AT2/上皮细胞和非典型上皮细胞与另一侧的纤毛上皮细胞和过渡上皮细胞之间的分化连续性（图4B）。此外，组织学评估证实了病理学家定义的肿瘤部位与AT2和循环AT2细胞之间重叠，从而表明它们的肿瘤细胞状态（图4C）。对于非典型上皮细胞，重叠较少（图4C）。

与背景相比，肿瘤中AT2细胞的差异表达分析（DEA）显示，肿瘤中涉及缺氧、TP53通路和代谢重组通路的基因上调。肿瘤中AT2细胞上调的基因参与糖酵解和氧化磷酸化的生物学过程（图4D）。虽然糖酵解在肿瘤细胞中的重要性已得到充分证实，但最近有报道称，人类NSCLC通过葡萄糖和乳酸为三羧酸（TCA）循环提供能量。此外，与背景AT2细胞相比，肿瘤AT2细胞表达更多的LYPD3（log2FC=2.04，P adj =0.039），LYPD3是一种粘附蛋白，此前已被发现与NSCLC预后不良有关，目前正成为临床前和临床研究的目标。

图4 CAML共享肿瘤CNA并与肿瘤细胞共定位。

有趣的是，在同一患者中的CAML细胞群还显示出大量与AT2细胞和循环AT2细胞相似的CNA（图4A、E）。为了以统计上稳健的方式测量不同细胞类型之间基因组获得和丢失分布的差异，研究者计算了Kullback-Leibler（KL）散度（图4F）。CAML具有与含有CNA的肿瘤细胞相当的KL散度值，从而证实了它们的CNA谱的相似性（图4F）。由于CAML同时表达多种髓系基因以及典型的上皮基因（图1D-F），具有低双联体得分并与肿瘤细胞共享相同的CNA特征，研究者假设这些细胞可能代表紧密附着于癌细胞的Mɸ子集。这些Mɸ可能正在经历吞噬作用或融合。

先前的研究已从癌症患者的外周血中分离出CAML，并发现其可促进循环肿瘤细胞的远处转移。这项分析表明CAML也可以从肿瘤组织中分离出来。为了验证CAML是否在物理上接近原位肿瘤细胞，研究者检查了STx切片，计算了所有切片（8名患者，20个切片 ）中共定位的细胞类型的相对丰度之间的Pearson相关性。分析结果表明，CAML确实与AT2细胞共定位（图4G、H）。使用非负矩阵分解（NMF）和cell2location估计的绝对细胞类型丰度证实了这一发现，该丰度定义了共现细胞状态的因素（图4I）。

为了确定CAML可能源自的特定Mɸ群体，研究者采用PAGA来阐明肿瘤数据集中髓系细胞群体的分化路径。分析揭示了不同髓系细胞群体之间分化转变的连续性。在PAGA轨迹内，肺泡Mɸ（AMɸ）和AIMɸ表现出高PAGA连接性，表明它们具有高度的转录相似性。AIMɸ和AMɸ在PAGA轨迹上均与STAB1+Mɸ表现出最强的连接性，而STAB1+Mɸ又与CAML相关联。根据轨迹分析，CAML共同表达了许多STAB1 +Mɸ特有的基因，支持以下假设：CAML很可能是在与肿瘤细胞密切相互作用后从STAB1+Mɸ衍生而来的。最后，研究对LUSC患者和LUAD患者的CAML进行DEA分析，结果显示LUSC样本中的KRT17、KRT5和KRT6A上调。这些KRT基因此前在多项研究中被确定为LUSC的标志物，这支持了CAML源自Mɸ与肿瘤细胞相互作用的假设。

Mɸ传统上被分为不同的M1（经典活化）和M2（替代活化）表型，现在人们认为它们存在于一系列动态功能状态。Mɸ能够根据微环境中的复杂线索在促炎和抗炎作用之间无缝转换。为了更好地了解不同Mɸ群体在TME中经历的转录变化，研究进行了DEA。与背景组织相比，在肿瘤中，AMɸ和AIMɸ均上调了涉及胆固醇和脂质转运和代谢的基因（例如ABCA1、APOC1、APOE、FABP3和FABP5）（图5A、B）。胆固醇在肿瘤生长中起着至关重要的作用，因为癌细胞增殖过程中对新合成的细胞膜的需求很高。与背景相比，肿瘤中的AT2细胞中缺氧相关基因上调（图4D），这可以通过抑制胆固醇合成来促进肿瘤细胞中的胆固醇营养缺陷，从而迫使它们依赖外源性胆固醇摄取。在此项数据集中，研究者检测到胆固醇输出蛋白ABCA1在AMɸ和AIMɸ中表达较高，而低密度脂蛋白受体（LDLR）没有表达，后者负责携带胆固醇的脂蛋白颗粒进入细胞，表明胆固醇优先从TAM输出到TME（图5A）。有趣的是，研究还注意到AMɸ和AIMɸ中TREM2的表达都很高（图5A），它在小胶质细胞胆固醇外流中起着重要作用。为了验证TME中胆固醇水平的增加，研究用BODIPY™ 493/503（一种针对胆固醇和其他中性脂质的染色剂）对匹配的肿瘤和背景组织切片进行了染色。结果发现，与背景组织相比，肿瘤切片中的BODIPY信号显著增加（图5C、D），证实了肿瘤中中性脂质的可用性增加，可能是TAM的输出增加所致。

图5 肿瘤巨噬细胞经历癌胎重编程。

 研究在肿瘤组织切片中发现了STAB1+Mɸ（图5E-H），基于此，研究使用DEA识别一组与肿瘤AIMɸ或AMɸ相比STAB1+Mɸ特异性的基因。总共识别了20个STAB1的特征基因（图5I）。有趣的是，STAB1+Mɸ独特地表达了SLC40A1，它编码了铁转运蛋白，这是唯一已知的将亚铁从细胞质中输出到质膜的蛋白质，是巨噬细胞释放铁活性的关键（图5I、J）。据报道，铁转运蛋白介导的M2 Mɸ释放游离铁可促进肾癌细胞体外增殖，可能是通过支持由于DNA合成增加而对铁的高需求来实现的。此外，与AMɸ相比，STAB1+Mɸ表达的铁蛋白重链1（FTH1）和铁蛋白轻链（FTL）编码水平较低（图5J）。这一结果与它们持续将游离铁输出到细胞外环境的假设一致，STAB1+Mɸ下调了与铁封存有关的基因（图5K）。综上所述，这项分析表明巨噬细胞在TME内经历“重编程”，并采用促进胆固醇外流和铁输出的转录特征，从而促进肿瘤进展。

胚胎发育与肿瘤组织有许多共同的特征，包括快速的细胞分裂、细胞灵活性和高度血管化的微环境。最近有报道称，在肿瘤发生过程中，Mɸ可以进行癌胚重编程并获得支持肿瘤生长和转移的胎儿样转录特征。考虑到一些STAB1特征基因通常由胎儿Mɸ表达（例如STAB1、FOLR2、SLC40A1、MERTK、GPR34和F13A1），研究者继续探索肿瘤起源的STAB1 +Mɸ和从人胎儿肺中分离的Mɸ之间是否存在进一步的转录共性。为此，他们使用Harmony将此项数据集中的肿瘤和背景来源的髓系细胞与公开可用的胎儿肺scRNA-seq数据集中的髓系细胞和祖细胞相结合。为了检查它们基因表达谱的相似性，他们应用了层次聚类，并相关性构建树状图（图6A）。

图6 STAB1+Mɸ进行癌胚重编程。

结果显示肿瘤cDC2与背景cDC2表现出最强的相关性，而肿瘤mo-DC2与胎儿DC2表现出最强的相关性。另外，来自肿瘤、背景和胎儿肺的pDC群体密切相关。同样，肿瘤单核细胞与胎儿经典单核细胞和背景单核细胞相关。肿瘤中的巨噬细胞群，特别是STAB1+Mɸ，与胎儿巨噬细胞相关。STAB1+Mɸ主要与胎儿SPP1+Mɸ聚集（图6A），占报告的所有胎儿肺巨噬细胞的80%以上。与其他造血细胞群相比，SPP1 +Mɸ具有较高的“STAB1标记基因”表达（图6B、C）。这项分析证实了以下观点：肿瘤环境中的单核细胞在分化为抗炎巨噬细胞时，会获得类似于胎儿巨噬细胞的转录标记。并且在周围正常组织的巨噬细胞中未观察到这种独特的转录标记。

为了进一步研究STAB1+Mɸ在其他病理（包括其他癌症）中的流行情况，研究者利用已发布的从12种不同的健康和病理组织中收集的人类单核细胞和Mɸ图谱（称为MoMac-VERSE），研究了STAB1特征基因在不同髓系细胞群体中的表达。在MoMac-VERSE中鉴定的HES1+巨噬细胞簇显示出最高的STAB1特征基因表达（图6D、E）。与STAB1+Mɸ类似，HES1+巨噬细胞在肺癌患者和肝癌患者的肿瘤中积聚，并被认为是具有胎儿样转录特征的长期驻留的Mɸ簇。

综上所述，这项分析表明，肿瘤巨噬细胞，尤其是STAB1+Mɸ，具有类似胎儿肺发育过程中表现出的转录特征，表明它们在NSCLC肿瘤环境中经历了癌胚重编程。

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