近日，大连工业大学食品学院、海洋食品加工与安全控制全国重点实验室、国家海洋食品工程技术研究中心朱蓓薇院士团队陈翊平教授在TOP学术期刊Analytical Chemistry (IF=6.7，自然指数期刊) 发表题为“Enhanced CRISPR/Cas12a fluorimetry via a DNAzyme-embedded framework nucleic acid substrate”的研究论文，陈翊平教授为通讯作者。
DOI：
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c04710
1. 开发了一种可增强Cas12a反式切割效率的框架核酸酶底物。
2. 开发了基于框架核酸酶和点击反应的增强型荧光传感方法。
3. 基于该方法可实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的免核酸提取免扩增高灵敏检测。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）可经食物链传播导致严重的食源性疾病，对其进行早期监测是保障食品安全和预防MRSA 感染性疾病的重要手段。近年来，CRISPR/Cas12a荧光法因其高选择性、简单、快速等优点，在生物传感领域得到了广泛的发展。在经典的CRISPR/Cas12a荧光法中，通常使用两端分别标记荧光团和猝灭剂的单链DNA，即TaqMan探针，作为Cas12a的反式报告探针。然而，这种TaqMan底物介导的Cas12a切割速率相对较慢，导致传统CRISPR/Cas12a荧光分析法只能实现nM级的灵敏度，不足以检测早期低丰度的MRSA。尽管有研究级联了靶标预扩增或信号扩增策略用于灵敏度增强。然而，这些方法仍然存在着气溶胶污染或复杂信号转导的困境，阻碍了它们的广泛应用。因此，迫切需要开发一种高灵敏度、简单、无污染的CRISPR/Cas12a荧光方法。
本工作开发了一种可增强CRISPR/Cas12a切割效率的框架核酸酶探针，并依此建立了框架核酸酶促点击反应介导的 CRISPR/Cas12a 荧光传感方法，用于 MRSA 的免提取、免扩增高灵敏检测。框架核酸酶由四面体基底和四条核酸酶垂悬链组成，其中核酸酶可在 Cu（II）作用下催化 3-叠氮基-7-羟基氧杂萘邻酮（3-azido-7-hydroxycoumarin，AHC）和 3-丁炔-1-醇（3-Butyn-1-ol，BOL）之间的点击反应，从而产生在 365 nm 下发蓝光的荧光分子。当体系中存在 MRSA 时，MRSA 可与 MNPs 表面功能核酸中的适配体结合，诱导释放出激活链，进而激活 Cas12a 对框架核酸酶的反式切割作用。此时，降解的核酸酶无法诱导发生点击反应，体系中无荧光信号。研究结果表明，框架核酸酶底物可增加Cas12a与底物接触速率，从而提高Cas12a反式切割效率，且CRISPR/Cas12a反式切割垂悬核酸酶时，四面体框架能保持其稳定性。CRISPR/Cas12a 的反式切割效率随框架核酸酶中局部核酸酶密度的增加而增加，对含4个核酸酶的框架核酸酶底物表现出最高的切割效率。该方法检测 MRSA 的线性范围为50 CFU/mL-106 CFU/mL，检出限为18 CFU/mL，检测性能优于传统荧光探针介导的CRISPR/Cas12a荧光方法。此外，本方法特异性良好，在食品样品中的加标回收率介于80%-101%之间，在 12 份牛奶样品检测中展现出与培养法相当的灵敏度和准确性。
图1 框架核酸酶底物介导的荧光生物传感示意图
图2 框架核酸酶的表征
图3 框架核酸酶性能评价
图4 条件优化
图5 生物传感器定量分析结果
图6 牛奶样品定量检测结果
通讯作者
陈翊平，大连工业大学教授，博士生导师，国家级人才支持计划青年项目获得者，当选中国食品科学技术学会第四届青委会委员。近5年以唯一通讯作者在Nature Food, ACS Nano, Advanced Science, Advanced Functional Materials, Food Chemistry等刊物发表中科院1区研究型SCI论文62篇（其中IF>15的论文7篇，自然指数期刊论文21篇, Hindex=40）。主持3项国家自然科学基金和1项国家重点研发课题，以第一发明人授权26项发明专利，其中7项发明专利实现了550万元的成果转化，研发的酶试剂已实现商业化。以第一完成人获得了湖北省科学技术发明二等奖和大北农科技创新奖，研究成果作为科创案例成功入选中国专业研究生案例库（编号：ZT-221050409）。担任SCI期刊Frontiers in Bioengineering and Biotechnology副主编（中科院二区）
本文转载自“工大食院”微信公众号，原标题“大连工业大学朱蓓薇院士团队陈翊平教授课题组在致病菌快速检测方向发表高水平文章”。转载仅用于学术分享，若有侵权，请后台留言联系修改或删除！
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