爱乳日特别解读 | Nature：单细胞结合空间多组学技术绘制人类乳腺细胞图谱

人类乳腺作为一种具备关键生理功能的腺体组织，其结构复杂，主要由错综复杂的导管系统、小叶结构以及丰富的结缔组织构成。传统研究大多聚焦于乳腺上皮系统，而对于非上皮细胞类型的认知则相对有限。随着单细胞测序技术的迅猛进步，研究人员拥有了前所未有的机会来深入剖析组织细胞的构成与表达模式。构建一张详尽的人类正常乳腺细胞图谱，对于深入理解乳腺发育生物学机制以及乳腺癌等乳腺相关疾病的发病机理至关重要。

然而，目前仍缺乏通过单细胞鉴定技术全面描绘正常人类乳腺所有细胞类型的研究。为了验证单细胞测序结果的准确性，研究人员需要借助正交技术进行进一步的确认，并明确各种细胞在组织中的精确空间定位。此外，不同人群背景（例如人种、年龄等因素）对乳腺细胞构成的具体影响，目前也尚不明朗，亟需开展更加深入的研究以揭示其中的奥秘。

研究团队致力于深入探索正常人乳腺组织的细胞构成与功能特性。他们首先精心收集了新鲜的乳腺组织样本，随后从这些样本中分别提取了单细胞和单核，利用单细胞转录组测序技术对这些细胞进行了深入分析，以精确识别出乳腺组织中的各种主要细胞类型。在成功鉴定出这些主要细胞类型后，研究团队进一步对这些细胞进行了细致的亚群分类，旨在更全面地揭示乳腺细胞中状态的多样性。为了验证单细胞图谱的准确性，并深入探究不同细胞类型在组织中的精确定位，他们采用了多种先进的空间分析技术。此外，结合大规模样本的数据，研究团队深入分析了不同人群背景对乳腺细胞频率的具体影响，以揭示更多关于乳腺组织生理功能和疾病发病机理的奥秘，为乳腺相关疾病的预防和治疗提供新的思路和方法。

1. 鉴定成人人类乳腺的主要细胞类型

HBCA项目对人类乳腺组织进行了深入的全面分析，通过对132名女性（主要为白种人和非洲裔美国人）的220份新鲜乳腺组织样本进行无偏倚3'单细胞RNA测序(scRNA-seq)，成功鉴定出成人乳腺组织中的12种主要细胞类型。这些细胞类型包括3种上皮成分（管腔激素反应性、管腔分泌和基底肌上皮），2种内皮细胞类型（淋巴和血管），3种免疫细胞类型（T细胞、B细胞和髓样细胞），以及2种间质细胞类型（成纤维细胞和血管周细胞），外加通过单核RNA测序(snRNA-seq)识别的脂肪细胞和肥大细胞。研究还发现，不同女性的细胞类型频率存在差异，但大多数女性均检测到所有细胞类型，且细胞类型频率在不同手术方式、解剖区域或分离方案间具有高度一致性。此外，细胞-细胞相互作用分析揭示了主要细胞类型之间的显著交互作用。

2. 乳腺主要细胞类型的空间分析

该研究采用了三种先进的技术——无偏倚空间转录组学(ST)、靶向单分子RNA荧光原位杂交(smFISH)和空间蛋白质组学分析的联合检测，对人类乳腺组织中细胞类型的空间分布与组织结构进行了深入研究。通过对10例患者进行ST分析，成功揭示了9种主要的乳腺细胞类型，并与scRNA-seq确定的细胞类型标记基因表现出较高的一致性，实现了原位验证。

此外，ST簇的频率与组织病理学注释的不同组织区域相对应，进一步验证了结果的准确性。为了验证ST分析中观察到的基因表达模式，研究者利用基于scRNA-seq数据中的顶级标记基因的定制基因面板进行了smFISH分析。在12例乳腺组织中，这些标记基因的原位表达得到了证实。smFISH数据的细胞分割和类型注释还揭示了上皮细胞类型与B细胞和T细胞的共定位，以及成纤维细胞类型与血管和淋巴细胞的共定位。不同组织区域的细胞类型频率定量也进一步支持了这些发现。

最后，研究者使用空间蛋白质组学分析和34种抗体组合，在蛋白质水平上研究了乳腺细胞类型的空间分布。空间蛋白质组学分析数据的细胞分割和无监督聚类显示了8个组织样本的细胞类型鉴定的一致性，蛋白质组学数据也证实了smFISH的结果。细胞邻近性分析进一步支持了smFISH中观察到的空间分布模式，表明该研究在揭示乳腺细胞类型空间组织方面取得了重要进展。

3. 人类乳腺上皮细胞

该研究通过组织病理学与无偏倚细胞聚集分析相结合的方法，深入探究了人类乳腺上皮的细胞类型及其特性。研究鉴定出三种主要的上皮细胞类型：基底型（Basal）、管腔分泌型（LumSec）和管腔激素反应型（LumHR）。其中，LumHR细胞特异性地表达激素受体核。细胞角蛋白基因表达分析进一步揭示了这三种上皮细胞类型具有细胞类型特异性的细胞角蛋白。

进一步的研究发现，每种上皮细胞类型内部都存在亚聚类，反映了不同女性的细胞状态差异。基底细胞表现出高度均一性，而LumHR细胞则呈现出与激素依赖性增殖相关的三种不同细胞状态。LumSec细胞展现出最大程度的多样性，包含七种不同的细胞状态，每种状态均具有特定的基因表达谱，涉及多种功能，如免疫信号传导、哺乳、细胞周期和肌肉收缩功能。

总体而言，该研究确定了11种上皮细胞状态，并发现这些细胞状态之间存在活跃的交互作用。细胞增殖主要局限于两个腔室，而在基底细胞中未检测到增殖。在LumSec和LumHR簇中发现了少量增殖细胞，且原位染色和转录本检测证实了导管和小叶区域均有管腔细胞增殖。

此外，研究还利用MERFISH分析确定了上皮细胞状态的空间分布。虽然一些细胞状态在导管和小叶中没有特定定位，但其他细胞状态则主要定位于导管或小叶。导管区与LumSec相关基因表达上调，而小叶区与LumHR相关基因表达上调。ST和smFISH等空间技术也证实了这些基因在乳腺导管和小叶区域的差异表达。空间蛋白质组学分析还显示，KRT5和KRT19在导管和小叶中的表达模式不同，且KRT5/KRT19双阳性细胞在导管结构中富集。

4. 人类乳腺组织中的免疫细胞生态系统

该研究运用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间分析技术，对人类乳腺组织中的免疫细胞组成和多样性进行了深入探究。研究涵盖了来自126名女性的119,866个细胞和来自20名女性的16,339个细胞核的scRNA-seq数据集，揭示了免疫细胞在乳腺组织中占据显著比例，占总细胞和细胞核的16.7%和13.9%。

通过空间蛋白质组学分析和smFISH技术的原位验证，进一步证实了免疫细胞的丰富性。研究将免疫细胞分为髓系细胞、自然杀伤（NK）细胞、T细胞和B细胞三大类，并在每个类别中识别出不同的子集。特别是在NK细胞和T细胞群中，鉴定出了14个亚群，包括初始T细胞、辅助性T细胞、效应性记忆T细胞、调节性T细胞、常驻记忆T细胞、CD8+ T细胞和γδ T细胞。B细胞群则分为三个主要亚群：记忆B细胞、血浆B细胞和初始B细胞。在髓系细胞群中，也鉴定出了树突状细胞（DCs）、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞的不同亚群。

空间转录组学技术的分析结果显示，免疫细胞存在于乳腺的所有三个主要组织区域（结缔组织、导管和小叶），且导管区和小叶区的免疫细胞密度高于结缔组织区。大多数免疫细胞表现出组织驻留表型，位于乳腺组织实质内。此外，研究还揭示了不同组织区域特异性免疫细胞亚群的分布差异。

利用smFISH技术进行的进一步空间分析为巨噬细胞和B细胞亚群的定位提供了深入见解。巨噬细胞亚群在结缔组织和上皮区域均有分布，其中巨m2细胞在结缔组织中数量较多，而巨m1细胞则主要存在于导管和小叶区域。B细胞则主要分布于上皮区，尤其是导管区和小叶区周围的间质。研究还预测了结缔组织区域中巨m2细胞与成纤维细胞之间可能存在的细胞相互作用。

5. 乳腺成纤维细胞和脂肪细胞

该研究深入探讨了人类乳腺中的乳腺成纤维细胞和脂肪组织的特性。在患者队列中，乳腺成纤维细胞占据了显著的比例，占细胞总数的29.2%和细胞核总数的15.1%。传统的组织病理学研究根据组织定位将乳腺成纤维细胞分为小叶内型和小叶间型。然而，通过对成纤维细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行重新聚类，研究人员发现了四种不同的细胞状态，这些状态在不同女性中表现出差异性。这些细胞状态与细胞外基质（ECM）重塑、胶原生成、前胶原形成、血管生成、组织重塑以及WNT信号通路相关。值得注意的是，在纤维-sfrp4细胞状态下，尽管癌相关成纤维细胞标志物FAP的表达较低，但仍略有升高。利用空间蛋白质组学分析技术的空间分析显示，成纤维细胞位于小叶间和小叶内两个区域。进一步的smFISH分析证实，特定基因的表达主要集中在小叶区域，并能够区分纤维基质、纤维前基质和纤维-sfrp4细胞状态。

同时，该研究也关注了乳腺中的脂肪组织。作为乳房的重要组成部分，脂肪组织在提供能量和激素方面发挥着关键作用。脂肪细胞是脂肪组织中的主要细胞类型，但由于其体积大、脂质含量高且脆弱，利用单细胞基因组学方法进行分析具有挑战性。在本研究中，研究人员利用单核RNA测序（snRNA-seq）和空间转录组学（ST）技术成功捕获了乳腺脂肪细胞的转录组谱。分析发现，ADH1B、CD36、PLIN1、PLIN4、ADIPOQ、FABP4、LEP和LPL等基因在乳腺脂肪细胞中表达最高，且这些基因在两个平台上的表达是一致的，表明乳腺脂肪细胞主要对应于白色脂肪细胞，且脂肪细胞间存在有限的细胞状态异质性。

此外，该研究还探讨了脂肪细胞、成纤维细胞和髓系细胞状态之间的潜在受体-配体相互作用。通过分析，研究人员确定了这些细胞类型之间的多种推测的相互作用，这表明在乳腺组织微环境中存在着潜在的交互作用。

6. 人类乳腺中的血管细胞、血管周细胞和淋巴细胞

该研究深入调查了人类乳房的血管和淋巴成分。通过组织病理学分析，研究人员在乳腺组织内观察到了复杂的血管网。进一步对内皮细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，结果显示在正常乳腺组织中，表达PECAM1和VWF的血管内皮细胞是一种主要且丰富的细胞类型。通过对scRNA-seq数据的重新聚类，研究人员揭示了三种主要的血管内皮细胞状态：动脉内皮细胞、静脉内皮细胞和毛细血管内皮细胞，这些细胞状态均基于其典型的标记基因进行区分。此外，研究还发现了与这些细胞状态相关的新顶级标记基因，为理解血管内皮细胞的异质性提供了新的视角。

在淋巴系统方面，研究以PROX1和PDPN表达为特征，鉴定了乳腺组织中的淋巴内皮细胞，尽管其频率相对较低。通过对淋巴细胞的scRNA-seq数据进行聚类分析，确定了四种主要的淋巴细胞状态，包括淋巴主要细胞、淋巴免疫细胞和两种淋巴瓣膜细胞状态。淋巴管主要由Lym-major细胞构成，而淋巴管免疫细胞则展现出与免疫细胞信号通路相关的趋化特征。淋巴瓣细胞则表达CLDN11，具有阻止淋巴液回流的重要功能。

为了验证血管和淋巴细胞状态的定位，研究采用了四种不同平台的空间分析技术。空间转录组学（ST）数据证实了与血管和淋巴细胞相对应的不同细胞簇的存在，这与血管结构的组织病理学观察结果一致。smFISH数据显示，较大的静脉结构主要分布在结缔组织中，而较小的毛细血管结构则整合在小叶和导管区域。同时，smFISH和空间蛋白质组学分析均支持淋巴细胞主要定位于结缔组织区域。此外，smFISH分析还揭示了毛细血管内皮细胞在导管和小叶区域的高度分布，以及动脉和静脉内皮细胞在结缔组织区域的富集。

此研究成功构建了首个详尽的人类乳腺组织细胞图谱，这一成就得益于单细胞转录组测序与多种前沿空间组学技术的综合运用。研究团队首先对126位女性患者的新鲜乳腺组织样本进行了深入的单细胞和单核RNA测序分析。通过整合这些宝贵的数据资源，研究者们成功鉴定并划分出了12种核心细胞类型，这些类型广泛涵盖了上皮、免疫、血管内皮及成纤维细胞等多个乳腺组织中的关键类别。

尤为值得一提的是，研究还进一步细分出了58种独特的生物学细胞状态，从而深刻揭示了乳腺组织中非上皮细胞的多样性和丰富性，特别是强调了驻留性免疫细胞在乳腺组织中的重要作用。

在上皮细胞层面，本研究取得了更为精细的界定成果。研究者们精确划分出了基底细胞、腺体腔分泌细胞以及腺体腔激素响应细胞这三大基本类型，并进一步将这些上皮细胞细分为11种具体的细胞状态。每一种细胞状态都展现出了独特的生物学特性与功能，从而为我们更深入地理解乳腺上皮细胞的复杂性提供了有力支持。

空间分布分析的结果显示，这些上皮细胞状态在导管和小叶区域均有广泛分布，但其分布密度与丰度却存在着显著的差异。

为了验证并丰富单细胞测序的结果，本研究还采用了四种不同的空间绘图技术。这些技术不仅成功验证了前期的发现，还进一步揭示了免疫细胞、成纤维细胞、血管及淋巴细胞等关键细胞类型与组织微环境之间复杂而微妙的相互关系。

此外，通过大规模样本的分析，研究者们还深入探究了人种与年龄因素对乳腺细胞频率的影响。在此基础上，研究团队建立了一个开放访问的在线数据库，这一数据库为乳腺生物学研究及乳腺癌研究领域提供了极为宝贵的细胞图谱资源，有望推动相关研究的深入发展。

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