李昭辉｜利用宏基因组二代测序技术检测原发性脊柱感染性疾病病原体的多中心研究

李昭辉 王月磊 殷楚强 沈峰 徐乙丹 王亭

｛青岛大学附属医院脊柱外科｝

张强

｛山东大学附属公共卫生临床中心骨外二科（骨感染）｝

于腾波

｛青岛大学附属医院骨外科｝

王华锋 

｛福州市第二总医院脊柱外科｝

马金龙

｛康复大学青岛医院（青岛市市立医院）康复医学科｝

连小峰

{上海交通大学医学院附属第六人民医院骨科}

通信作者：王亭，tingwang@qdu.edu.cn；连小峰，liuaihuadoctor@163.com

摘　　要

目的　探讨宏基因组二代测序技术（mNGS）诊断原发性脊柱感染性疾病（IDS）病原体的价值，并分析IDS的病原体谱。

方法　本研究为回顾性、多中心病例系列研究。回顾性分析2019年12月至2024年4月于中国4个医疗中心就诊的380例原发性IDS患者的临床资料。其中青岛大学附属医院脊柱外科82例，山东大学附属公共卫生临床中心骨外二科（骨感染）129例，福州市第二总医院脊柱外科112例，上海交通大学医学院附属第六人民医院骨科57例。男性238例，女性242例，年龄（61.4±13.1）岁（范围：10~91岁）。所有患者通过病灶穿刺或术中获取脊柱感染部位标本进行病原体培养、病理学检查和mNGS检测。分析传统检测方法与mNGS检出的病原体数量、种类及阳性率，并采用χ2检验进行比较。

结果　在380例患者中，320例明确病原体，其中化脓性细菌感染的比例占76.9%（246/320），最常见的是金黄色葡萄球菌（22.8%，73/320）；布鲁氏菌感染占13.8%（44/320）；结核分枝杆菌感染占6.3%（20/320）。真菌感染占3.4%（11/320），主要为曲霉菌和念珠菌。此外，检出支原体3例（0.9%）和贝纳柯克斯体4例（1.2%）。通过mNGS检测构建的病原体谱涵盖46种致病微生物，高于传统检测方法的22种。mNGS的阳性率为80.8%（308/381），高于传统检测方法的27.9%（106/381）（χ2=182.53，P<0.01）。

结论　mNGS提高了IDS病原体诊断的阳性率，检测出更广泛的病原体谱，是传统病原体培养检测方法的有益补充。在IDS诊断中结合使用两种方法，可提高检出率，为精准抗感染治疗提供坚实依据。

脊柱感染性疾病（infectious diseases of spine，IDS）指由不同病原微生物引起的脊柱不同部位感染，包括椎体、椎间盘、附件（横突、椎弓根、关节突、椎板、棘突）、椎管和邻近椎旁组织感染等，占全身骨骼肌肉系统感染的2%~7%［1, 2］。不同病原微生物引起的脊柱感染的临床、影像学表现，实验室及组织病理学检查结果的特异性不高，很难据此推断致病菌。明确病原体是IDS 治疗的关键，在准确诊断病原体基础上进行针对性用药，可使超过90%的患者达到治愈［3］。目前，传统的病原学培养、免疫学检测和PCR是检测IDS病原体的主要方法，但其准确性和检测范围有限，难以满足IDS复杂多变的病原体检测需求。既往文献报道的IDS患者血培养阳性率为30%~50%［4］，而病灶穿刺标本培养的阳性率低于60%［5］。对于缺乏病原体证据的IDS患者，治疗方案只能依赖经验性用药或诊断性治疗，需使用广谱或多种抗菌药物，增加了相关并发症和细菌耐药风险。近年来，宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术在感染性疾病病原体诊断方面得到广泛应用，其准确性高，检测范围广，显示出良好的应用前景［6］，但既往多为单中心和小样本研究［7, 8, 9, 10, 11, 12］。我们对我国4家医疗中心的IDS患者的病原菌检测情况进行回顾性分析，旨在探讨mNGS技术在诊断IDS方面较传统方法的优势，并且分析IDS的病原体谱。

纳入标准：（1）根据病史、临床症状、实验室和影像学检查、组织病理学及抗感染治疗效果综合分析诊断为IDS；（2）于病灶穿刺或术中获取病灶标本；（3）病灶标本行细菌培养、病理学检查及mNGS检测。

排除标准：（1）临床资料缺失；（2）病灶标本污染。

本研究为回顾性、多中心病例系列研究。回顾性分析2019年12月至2024年4月于4家医疗中心就诊的符合纳入及排除标准的380例IDS患者的临床资料。其中青岛大学附属医院82例，山东大学附属公共卫生临床中心129例，福州市第二总医院112例，上海交通大学医学院附属第六人民医院57例。男性238例，女性242例，年龄（61.4±13.1）岁（范围：10~91岁）。其中腰椎感染313例（82.4%），胸椎感染43例（11.3%），颈椎感染14例（3.7%），腰骶椎感染8例（2.1%），胸腰椎感染2例（0.5%）。主要临床表现为病灶部位疼痛和发热，部分患者伴下肢放射痛。入院时白细胞计数（6.93±3.03）×109/L（范围：1.82×109/L~31.50×109/L），C反应蛋白30.3（53.6）mg/L（范围：0.02~296.56 mg/L），降钙素原0.05（0.08）μg/L（范围：0.01~5.26 μg/L），红细胞沉降率（60.83±34.99）mm/1 h（范围：0.74~157.00 mm/1 h）。合并糖尿病77例（20.3%），高血压病99例（26.1%）。

本研究经青岛大学附属医院伦理委员会审核批准（批号：QYFY WZLL 28856），所有患者签署相关检查和治疗的知情同意书。

二、检查方法与观察指标

所有患者入院后完善并定期复查血常规、C反应蛋白、降钙素原、红细胞沉降率等感染指标及影像学检查（CT、MRI），同时完善特异性实验室检查，如布鲁氏菌凝集试验、真菌G试验、真菌GM试验、结核感染T细胞斑点试验等。临床上综合判断怀疑为脊柱感染性病变，则立即行C形臂X线机或CT引导下感染病灶穿刺，或在手术中获得脊柱感染病灶标本。所有患者入院后和发热时抽取血培养。所有标本进行组织培养和病理学检查，同时行mNGS检测。传统细菌培养由微生物室专业人员采用全自动细菌培养分析仪进行分离培养鉴定。mNGS标本在严格无菌条件下外送第三方公司检测。由脊柱感染疾病专家小组（包括脊柱外科医师、医学微生物学专家和临床感染科医师）对患者的诊断、治疗等进行决策。

所有患者在未明确病原微生物类型前，先采取经验性抗感染治疗，方案为万古霉素联合三代或四代头孢菌素，若出现过敏反应或不耐受等情况，替代方案为达托霉素联合喹诺酮类药物［13］。待传统检测及mNGS检测反馈结果后，及时调整抗生素治疗方案进行靶向抗感染治疗。

传统检测方法的病原体诊断标准：（1）化脓性细菌：微生物培养阳性；（2）布鲁氏菌：布鲁氏菌抗体阳性且血清凝集实验结果>1∶160或微生物培养阳性；（3）结核分枝杆菌：微生物培养、抗酸染色涂片、典型的病理或原位荧光PCR任一阳性；（4）真菌：涂片、培养或病理学检查阳性。

mNGS的病原体诊断标准：（1）化脓性细菌或布鲁氏菌：属相对丰度>15%，且序列数>40；（2）结核分枝杆菌：序列数≥1即为阳性；（3）真菌：属相对丰度>15%，且序列数>50；（4）临床罕见的病原体：属相对丰度>10%，同时序列数>10。

记录传统检测方法和mNGS确诊病原体数量和种类，比较两组病原体阳性率。

三、统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行统计学分析。符合正态分布的定量资料以x¯±s表示，不符合正态分布的定量资料以M（IQR）表示；分类资料以频数（百分数）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 传统检测方法检出的原发性脊柱感染疾病病原体的种类及分布

二、mNGS诊断病原体情况

380例IDS患者标本均接受了mNGS检测，共行381次mNGS检测，其中308例（80.8%）结果呈阳性。检测出五类共46种病原体：其中化脓性细菌占235例（76.3%）；结核分枝杆菌17例（5.5%）；布鲁氏菌42例（13.6%）；真菌11例（3.6%）；支原体3例（1.0%）。检出频率最高的20种病原菌见图2。

图2 宏基因组二代测序技术检出的原发性脊柱感染疾病病原体种类分布及检出最多的20种病原体种类

三、脊柱感染病原体分布特征

在380例IDS患者中，共320例明确病原体，包括318例单一病原体和2例混合感染。本研究建立了IDS的病原体谱，涵盖47种病原体（表1）。其中，化脓性细菌的比例最高，占76.9%（246/320）；其次为布鲁氏菌，占13.8%（44/320）；结核分枝杆菌占6.3%（20/320）；真菌占3.4%（11/320）。

本组IDS最常见的6种病原菌分别为金黄色葡萄球菌（22.8%，73/320）、布鲁氏菌（13.8%，44/320）、链球菌（11.3%，36/320）、大肠埃希菌（8.1%，26/320）、表皮葡萄球菌（6.3%，20/320）、结核分枝杆菌（6.3%，20/320）（表2）。此外，还检测到支原体（3例）、贝纳柯克斯体（4例）等罕见病原体。

本组患者共检测出11例真菌感染，包括7例曲霉菌和4例念珠菌。在7例曲霉菌感染中，5例仅通过mNGS检测出，1例同时通过mNGS和真菌培养检测为阳性，另1例则通过mNGS和病理学检查确诊。4例念珠菌感染中，2例仅通过mNGS检出，另2例mNGS和真菌培养均为阳性。

在44例脊柱布鲁氏菌感染病例中，mNGS检测阳性率为95.5%（42/44），凝集试验阳性率为81.8%（36/44），培养阳性率为20.5%（9/44）。在20例结核病例中，mNGS检测阳性率为85.0%（17/20），培养阳性率为3/17，PCR检测阳性率为12/17，结核分枝杆菌核酸检测阳性率为6/19，病理学检测阳性率为7/19（表3）。

四、传统方法和mNGS诊断方法的比较

在本研究中，mNGS检测的阳性率为80.8%（308/381），传统检测方法为27.8%（106/381），其中微生物培养阳性率为26.0%（99/381）；mNGS联合传统方法的阳性率为84.0%（320/381）。mNGS的阳性率明显高于传统检测方法，差异有统计学意义（χ2=182.53，P<0.01）。在传统方法检测的22种病原体中，mNGS检测到21种，占95.5%；而在mNGS检测的46种病原体中，传统方法仅检测到21种（45.7%）。mNGS建立的IDS病原体谱比传统方法更全面，包括贝纳柯克斯体、支原体、微小微单胞菌、棒状杆菌、普雷沃菌和沙门菌等少见菌。此外，mNGS检测在72.9%（183/251）的传统检测方法阴性样本中检出了病原体，其中包括金黄色葡萄球菌43例、链球菌25例、表皮葡萄球菌14例、大肠埃希菌13例、布鲁氏菌8例。而传统检查方法仅在16.4%（12/73）的mNGS检测阴性样本中检测出病原菌，其中包括3例结核分枝杆菌、2例布鲁氏菌。

本组传统方法诊断的IDS均为单一病原菌感染，而mNGS则能够同时检测出多种病原菌。在1例混合感染病例中，mNGS检测出牙卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和星座链球菌3种致病菌，而传统方法仅培养出星座链球菌［14］。该患者在牙髓根管治疗术后出现肩背疼痛伴发热，临床诊断为血行播散导致的原发性脊柱混合感染。

原发性脊柱感染是相对少见的脊柱疾病，发病率（2.2~5.8）例/10万人年［15］，在各年龄段均可发病，尤其好发于50~60岁成年男性。当无法确定致病微生物时，治疗通常依赖经验性广谱抗菌药物，增加了多重耐药菌的风险，可能导致治疗失败和病原体进一步传播［16］。

一、原发性脊柱感染的病原体谱

本研究结果显示，传统检测方法建立的病原体谱包含22种病原体，明显少于mNGS检测建立的46种。比较两种方法建立的病原体谱，我们发现传统检测方法对于低毒力的病原体，特别是需要特定培养基和培养条件的病原体，如布鲁氏菌、结核分枝杆菌、真菌、苛养菌、厌氧菌等的检出率极低。与传统检测方法相比，mNGS检测发现了人型支原体、贝纳柯克斯体、伤寒沙门菌等脊柱感染罕见病原体，拓宽了对脊柱感染病原体谱的认识。此外，传统检测方法的阳性率为27.9%，难以指导临床靶向应用抗菌药物。mNGS检测的阳性率为80.8%，明显高于传统检测方法，且mNGS在72.9%的传统检测阴性样本中检出了病原体。最近，一项纳入141例脊柱感染患者的研究结果表明，mNGS的检出阳性率为80.9%，明显高于传统培养的59.6%，mNGS检出最多的致病菌为结核分枝杆菌，其次是金黄色葡萄球菌［11］。另一项纳入158例脊柱感染患者的研究表明，mNGS的阳性率为86.32%，明显高于传统培养的19.57%，mNGS检出最多的致病菌为结核分枝杆菌，其次是金黄色葡萄球菌，培养检出最高的为金黄色葡萄球菌［17］。与本研究与上述研究结果相比，检出率相近，但在致病菌分布方面略有差异，本研究中检出最多的为金黄色葡萄球菌，其次是布鲁氏菌，这可能与地区差异及当地流行病学有关。本研究中传统检测方法的阳性率较低，我们分析可能的影响因素包括：（1）研究中包含的4个医疗中心都是各自地区的三级医院，收治的患者可能已经在下级医院进行了血清学和血液学实验室检测或影像学引导下的活检，结果显示为阴性，并接受了经验性抗感染治疗，导致传统检测方法阳性率较低；（2）本组患者中mNGS检测到25种通过培养未发现的病原体，包括大量稀有病原体，如胞内细菌、苛养菌、厌氧菌（脆弱拟杆菌、普雷沃菌属、痤疮丙酸杆菌）等，这些病原体对培养环境有严格要求且生长缓慢，导致传统检测方法检出困难；（3）临床环境中缺乏对稀有病原体的常规筛查，导致了传统检测率低；（4）不同医疗中心在样本采集、处理和存储上的差异可能影响培养结果。

mNGS近年来广泛应用于感染性疾病的病原体诊断。该技术不基于病原体培养，可直接从临床样本中提取全部微生物的DNA，利用基因组学策略分析样本中的全部微生物，具有检测速度快、准确率高、覆盖范围广的特点，是一种非靶向广谱病原学筛查技术。尤其对于检测混合感染、苛养菌感染、真菌以及少见病原体等方面具有独特优势，常能发现罕见且意想不到的病原体，较好地弥补了传统检测方法的不足［18, 19, 20］。这项技术提高了临床对感染性疾病的认识，成为精准诊疗的重要基础。

二、不同病原体检测方法的诊断价值

本研究通过比较传统检测方法和mNGS检测IDS病原体的结果，发现存在以下情况：（1）两种方法一致（31.0%，118/381）。其中化脓性细菌占61.0%，布鲁氏菌占28.8%，结核分枝杆菌占6.8%，真菌占3.4%，检出最多的致病菌为布鲁氏菌。对于此种病例，临床医师对病原体更为确定，对治疗方案更有信心，增加了临床治疗目标性。（2）两种方法结果不一致（1.8%，7/381），即均为阳性但结果不同。此时需结合患者临床表现、实验室指标、影像学检查等综合判断，并考虑mNGS检测的病原菌序列数。如病情允许，需再次采样送检。（3）两种检测方法1种阳性，另外1种阴性（51.2%，195/381）。由于mNGS检测的灵敏度更高，检测范围更广，这种情况多是传统检测方法阴性，mNGS检测阳性。其中化脓性细菌占85.6%，布鲁氏菌占5.1%，结核分枝杆菌占4.6%，真菌占3.6%，支原体占1.0%，检出最多的致病菌为金黄色葡萄球菌。（4）临床诊断感染，但两种方法结果均为阴性（15.7%，60/381）。需再次对影像学显示的感染病灶核心进行活检并二次检测，以明确病原体。少部分最终仍难以明确病原体的病例，可通过经验性治疗，观察效果。本研究中1例患者第1次mNGS检测阴性，经验性抗感染治疗无效，10 d后再次穿刺取标本行mNGS检测提示贝纳柯克斯体，传统检测方法始终未检出病原菌。我们分析第一次mNGS检测阴性的可能原因有：（1）感染早期阶段病灶处的病原体负荷较低，采集的样本中病原体数量不足；（2）穿刺时未穿到病灶核心部位或样本在保存、运输中出现问题。

三、mNGS检测及本研究的局限性

作为一项新兴技术，mNGS凭借诸多优点正快速从实验室向临床转化，随着测序成本的下降，mNGS的临床应用将日益增多［21］。然而，mNGS检测也有其局限性：（1）缺乏统一的测序结果解释标准；（2）对背景菌群和病原菌的区分缺乏明确的标准。因此，对于mNGS诊断致病微生物的标准需要同行专家讨论和改进，以便更准确解读mNGS检测结果，进一步降低假阳性率。

本研究样本量较大，描述了较广的IDS病原体谱，并报告了一些少见病原体，为临床医师治疗IDS提供了思路，但也存在不足：（1）本研究为多中心回顾性研究，mNGS检测由多个公司完成，不同公司在标本处理、核酸提取、测序方法以及生信分析等方面都存在差异，势必影响mNGS结果的解读。（2）不同单位使用的传统病原体培养方法和检测项目不同，造成不同中心培养结果阳性率有差异。（3）回顾性研究固有的选择偏倚等。

综上所述，对于IDS，传统病原体检测方法操作简单，且可进行药物敏感性试验，目前仍被认为是诊断IDS的“金标准”，mNGS则是有益补充。由于脊柱感染病灶标本采集难度大、成本高且有神经和血管损伤风险，因此在选择病原体检测方法时，应该使用包括传统检测方法和mNGS在内的多种检测手段，以提高单次取样的阳性率。随着测序技术的快速发展，mNGS的检测速度和准确性将不断提升，在IDS精准诊断中将发挥越来越重要的作用。

题图  via  伊萨克·伊里奇·列维坦 《October (Autumn)》