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微生物在根际的有效定殖对于与宿主植物建立有益的共生关系至关重要。枯草芽孢杆菌作为一种广泛分布的土壤细菌，通常与植物及其根际共生，并因其在促进植物生长、抑制病原体和促进可持续农业实践的潜力而备受关注。然而，由于现有原位检测方法的局限性，对枯草芽孢杆菌在根际的动态分布及其与植物根系相互作用机制的认识仍不够深入。
近日，浙江大学徐建明教授团队开发了基于微流控技术的平台iRhizo-Chip，以实现根际环境的动态原位检测。通过该装置研究根际微生物行为，研究发现枯草芽孢杆菌在根际的生长存在显著的昼夜波动，并进一步证明该昼夜波动现象受根际溶解氧和pH变化的驱动，同时这项研究展示了iRhizo-Chip在探究植物根际动态过程中的广泛应用潜力。
这项研究于北京时间2024年9月26日在线发表在《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），浙江大学环境与资源学院博士生戴恒毅为论文的第一作者，徐建明教授和马斌副教授为通讯作者，浙江大学为第一和通讯作者单位。本研究得到国家自然科学基金创新研究群体项目等资助。
主要结果
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iRhizo-Chip的特性和功能
为了实现更接近自然土壤条件根际环境的原位研究，同时结合微流控芯片的透明特征和技术高度集成的优势，本研究设计了iRhizo-Chip平台——一个具备高时间和空间分辨率的动态原位检测微流控平台（图1A-F）。iRhizo-Chip再现了天然水稻根际的关键特征，包括微氧到厌氧的氧化还原条件以及矿物质营养的化学环境。此外，iRhizo-Chip与多种原位检测技术（PO、DGT等）的兼容性，使其能够对多种环境因子进行实时动态监测和空间分布分析。
图1 iRhizo-Chip装置图
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根际枯草芽孢杆菌生长的昼夜波动
为了实现对根际微生物生长和空间分布的高时间、空间分辨率原位监测，本研究结合iRhizo-Chip平台、共聚焦显微成像技术和流式细胞术，对枯草芽孢杆菌在根际的定殖与生长情况进行了监测。通过流式细胞术，得到了枯草芽孢杆菌在根际定殖数量的昼夜变化（图1G）。研究发现，枯草芽孢杆菌在水稻根际的生长呈现出规律性的昼夜波动。在连续三天的昼夜监测过程中，白天枯草芽孢杆菌快速生长，根际孔隙水中细菌浓度达到5,000-10,000 cell mL⁻¹；进入黑暗期后，细菌浓度迅速下降至2,000-3,000 cell mL⁻¹。这一结果不仅揭示了枯草芽孢杆菌生长响应昼夜节律的动态特性，还进一步验证了iRhizo-Chip在原位微生物动态分析中的强大应用潜力。
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枯草芽孢杆菌在水稻根际的定殖分布
通过对获取的荧光图像进行分析，研究团队绘制了枯草芽孢杆菌在水稻根际的定殖分布。沿着根径向轴的统计分析显示，枯草芽孢杆菌丰度呈现梯度分布，距离根表面越远，细菌丰度越低，其中相当一部分细菌直接定殖于根表面（图2A）。进一步分析表明，枯草芽孢杆菌在根表面的定殖并不均匀，根尖及其附近的伸长区定殖水平显著高于成熟区（图2B）。此外，荧光图像中枯草芽孢杆菌的空间分布还表现出时间动态特征，荧光信号计数与流式细胞术数据中观察到的昼夜波动相一致。在光照阶段，荧光计数迅速增加至1,300,000-1,400,000，而在黑暗阶段，数量则下降至900,000-1,100,000（图2C）。
图2 根际枯草芽孢杆菌的昼夜变化
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枯草芽孢杆菌的生长与根际多种环境因素的动态变化相关
本研究利用iRhizo-Chip平台，结合PO、ROS探针和TOC分析仪，对水稻根际的溶解氧（DO）、pH、活性氧（ROS）和溶解有机碳（DOC）进行了原位动态监测。与先前研究一致，结果显示这些环境因素呈现显著的昼夜波动（图3A），可能对根际枯草芽孢杆菌的生长模式产生影响。线性回归分析表明，枯草芽孢杆菌的生长动态与DO、pH和ROS呈显著正相关，与DOC呈负相关（图3B）。这些关联性说明，氧气供应的增加、适宜的pH条件以及氧化应激状态有利于枯草芽孢杆菌的增殖和代谢活动；相反，与DOC的负相关性表明有机碳可用性的变化可能会抑制其生长动态。这些发现揭示了根际微生物生长动态与环境因素之间复杂的相互作用，为深入理解这一复杂系统提供了重要线索。
图3 枯草芽孢杆菌的生长与根际多种环境因子的动态变化相关
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枯草芽孢杆菌生长与DO和pH之间的空间相关性
通过对iRhizo-Chip获取并经ImageJ处理的图像进行数值数据提取，我们分析了根际DO和pH的空间分布动态（图4A）。结果显示，枯草芽孢杆菌定殖变化与DO和pH水平的波动具有高度的空间一致性（图4B）。
图4 枯草芽孢杆菌生长与DO和pH之间的空间相关性
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DO和pH触发水稻根际枯草芽孢杆菌生长的昼夜变化
根际环境中枯草芽孢杆菌生长的昼夜波动受到多种理化指标变化的影响（图5A），其中溶解氧（DO）是一个关键因素。根系的径向泌氧显著影响根际氧化还原电位，导致离子价态昼夜波动及有机物从还原态到氧化态的转变。在有氧和厌氧条件下的纯培养实验进一步证实了氧气对枯草芽孢杆菌生长的关键作用（图5B）。此外，pH作为土壤化学中的重要变量，也被证实是微生物群落结构及微生物活性的关键驱动因素。在水稻根际，pH的波动范围从夜间的4.9到白天的5.3，培养实验结果表明，相较于较低的pH（4.9），较高的pH条件（5.3）显著增强了枯草芽孢杆菌的生长（图5C）。
同时，本研究还评估了DOC和ROS对枯草芽孢杆菌生长动态的影响。线性回归分析显示，枯草芽孢杆菌的生长与DOC呈负相关，而与ROS呈正相关。然而，纯培养实验却表明，DOC浓度的增加显著促进了枯草芽孢杆菌的生长（图5D）；同样，虽然低浓度ROS可以被枯草芽孢杆菌耐受，但高浓度ROS会显著抑制其生长（图5E）。这些结果表明，DOC和ROS虽然影响枯草芽孢杆菌的生长，但可能并非决定性因素。
图5 枯草芽孢杆菌生长的昼夜波动是由根际溶解氧和pH值的变化引起的
研究结果表明，iRhizo-Chip能够实时监测根际枯草芽孢杆菌的动态行为，具有极高的时间和空间分辨率。这为深入理解自然条件下植物与微生物之间复杂的相互作用提供了全新途径，并极大地提升了我们对根际界面多要素动态的认知。枯草芽孢杆菌的昼夜波动揭示了微生物群落对环境变化的响应与宿主植物生理节律的密切关联。这一关联性突显了在微生物接种及生物施肥策略开发中融入微生物群落生长时间动态的必要性，有望推动更高效、更环保的农业实践。
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理解根际微生物定殖的复杂动态对于建立有益的共生关系至关重要。然而，原位检测的局限性阻碍了对根际定殖动态的深入探索，特别是针对枯草芽孢杆菌等有益菌。本研究首次报道了根际枯草芽孢杆菌生长的昼夜波动，并阐明了溶解氧和pH在驱动这一波动中的关键作用。通过揭示微生物生长与环境因素动态之间的密切关系，本研究为植物与根际微生物之间复杂相互作用提供了宝贵见解，为增强农业生态系统的理解和管理铺平了道路。
论文链接
https://doi.org/10.1073/pnas.2408711121
第一作者简介
戴恒毅，浙江大学土壤学专业博士（农+X交叉联培航空航天学院），主要研究方向为基于微流控技术的根际生态过程研究。以第一作者和共同第一作者在PNAS、Environmental Science & Technology等期刊上发表论文。
通讯作者简介
个人主页：https://person.zju.edu.cn/bma
徐建明，浙江大学求是特聘教授，长期从事土壤质量与过程、土壤污染控制与修复等领域的研究，主持完成国家自然科学基金创新研究群体项目及重点项目、国家重点研发计划项目等，在Nature及子刊、PNAS、ISME J、Microbiome等国际学术刊物发表SCI论文400余篇。曾获国家杰出青年基金，被聘为教育部长江学者特聘教授，当选美国农学会、美国土壤学会、中国土壤学会会士。
个人主页：https://person.zju.edu.cn/0091258
来源： 农环视界
