暨南大学高昊/胡丹组和波恩大学Dickschat组合作Angew ｜序列高同源，功能显差异：全新四环骨架二萜环化酶AfAS的发现

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AfAS与PaFS高度同源，然而它们却产生两种完全不同骨架的产物。PaFS的环化机制已有报道（图2）：GGPP首先发生C1-C11/C10-C14合环得到C15位碳正离子中间体A，然后发生1,2-H^-迁移得到C14位碳正离子中间体B，随后C10的质子重排到C2位得到中间体C；接着该氢继续重排到C6位得到中间体I，然后经历1,2-H^-迁移、C2-C6合环、脱氢生成5-8-5三环产物fusicocca-2,10(14)-diene（5）。基于AfAS与PaFS在氨基酸序列上的高度相似性，作者推测AfAS与PaFS前期通过类似的步骤得到中间体C。与PaFS不同的是（图2），来源于C10位的氢继续重排到C3位并发生C2-C6合环得到碳正离子中间体D1（路径a）。中间体D1通过C6-C7的旋转发生构象变化得到C19甲基朝下的中间体D2。然后发生Wagner-Meerwein重排，伴随C6-C10成键得到中间体F，最后脱氢得到1。此外，推测分支产物4为中间体B发生1,2-H^-迁移得到中间体G后脱氢形成，而化合物3推测由中间体C脱氢形成。

为了验证上述推测的环化机制（图2），作者展开了一系列同位素标记实验。首先开展GGPP所有20个碳的分别标记实验，验证了中间体D2至F的Wagner-Meerwein重排过程。以(15-¹³C,14-²H)GGPP为底物进行体外酶催化实验获得被标记的化合物1，核磁共振测试发现C15的碳谱由于碳-氘耦合裂分成三重峰，证明了A到B的氢迁移过程。GC-MS分析发现化合物3和4的形成也经历了同样的氢迁移过程。接下来以(10-²H)GGPP底物进行体外酶催化实验获得被标记的化合物1和3的分子量均为273，这说明化合物3的形成并不是由C10位脱氢而形成。为了探究在化合物1和3的形成过程C10氢的去向，分别以(2,6-¹³C₂,10-²H)GGPP和(3,7-¹³C₂,10-²H)GGPP为底物进行体外酶催化实验，发现化合物1和3的形成过程中C10氢都迁移到了C2位，进一步确认了中间体B到C的1,4-H⁺迁移过程。接着，以(3-¹³C,2-²H)GGPP为底物进行标记实验，发现化合物1和3的分子量均为273，而不是274，说明在化合物1和3的形成过程中，GGPP中C2位原本的氢被脱去，中间体D1的形成并非直接由中间体C发生1,2-H-迁移所致（途径a），同时也提示化合物3很有可能是环化过程中的重要中间体。为了证明中间体D1的形成过程，作者以(3-¹³C)GGPP为底物在氘水环境中进行标记实验，核磁共振以及GC-MS测试结果显示化合物1的C3位被氘标记，说明中间体C脱去C2位原本的氢生成化合物3，然后由水介导C3位的质子化，协同C2-C6环合得到中间体D1（途径b）。也就是说，从中间体C至D1路径中涉及特殊的邻位脱质子-再质子化过程。

此外，以(10-²H)GGPP为底物进行体外酶催化实验也证明了化合物4的形成经历了中间体B到G的过程，以(3-¹³C,2-²H)GGPP为底物的标记实验显示化合物4的C2位原本的氢也被脱去。因此，中间体G很可能是发生1,5-H⁺迁移得到中间体H，然后再脱去C2位原本的氢得到化合物4。与此推论一致，同位素标记实验确认了化合物4的形成过程中C9位的pro-R氢迁移到了C2位。

同位素标记实验表明中间体C到D1过程走的是路径b，与更简洁的路径a相比，AfAS为什么会选择更复杂的路径b呢？为了探讨这个问题，作者对中间体A至F的形成过程进行了DFT计算。结果表明，如果走路径a，其最高能垒为7.9 kcal/mol，并不高。为了更好的理解AfAS选择b途径的原因，作者基于MgMS和SdS的机制研究，提出了由水分子介导的邻位脱质子-再质子化过程（图3），结果发现水合氢离子在酰胺羰基（蛋白质的主链羰基）的稳定下，中间体C中C2位的氢可以无能垒地转移到水分子中，得到中间体3_W_C，然后跨过4.5 kcal/mol的能垒，C3位被水质子化，并协同C2-C6合环得到中间体D1。与途径a 7.9 kcal/mol的能垒相比，由水分子介导的邻位脱质子-再质子化过程能垒更低，但其具体的机制还有待进一步研究。

AfAS与PaFS的早期环化过程相同，却在中间体C处发生分支，产生不同的产物。为了探究发生分支的机制，作者通过AlphaFold2预测了AfAS的三维结构，并将化合物3对接进其活性口袋中得到AfAS-3的蛋白模型，同时将化合物3也对接到PaFS晶体结构中，然后对这两个对接模型进行重叠对比分析。结果显示AfAS与PaFS的活性口袋基本一样，除了第65位的氨基酸外（图4）。在AfAS中65位为异亮氨酸（I），而PaFS中为苯丙氨酸（F）。于是，作者将AfAS的65位异亮氨酸突变成苯丙氨酸，AfAS^I65F突变体仍然产生1，但其还能产少量的5，以及少量的3，4和6。而当65位异亮氨酸突变成酪氨酸后，AfAS^I65Y突变体中化合物1的产量明显降低，并以化合物5为主产物，同时产生少量的化合物3和6。上述结果说明将AfAS中65位的异亮氨酸突变成芳香氨基酸后，其获得了PaFS功能。另一方面，当PaFS的第65位苯丙氨酸（F）突变成异亮氨酸（I）后，PaFS^F65I突变体只产化合物1，不再产化合物5。作者还对AfAS和PaFS的65位氨基酸进行了饱和突变，结果表明65位的芳香氨基酸残基（F，Y，W）对于生成三环产物5至关重要，而支链氨基酸（I，L，V）倾向于产化合物1，说明65位氨基酸是AfAS和PaFS酶功能切换的关键开关。

突变实验表明65位氨基酸残基是AfAS与PaFS功能互换的关键，然而在对接模型中第65位残基位于中间体C的C15位上方，距离其反应中心（C2和C6位）较远。作者推测65位氨基酸残基可能是通过选择性固定中间体C的构象，从而影响其走向中间体D1生成化合物1（AfAS和PaFS^F65I），或者走向中间体I生成化合物5（PaFS和AfAS^I65Y）。与这一假设相一致的是，在AfAS和PaFS对接模型中观察到中间体3的结合构象显著不同，而PaFS^F65I突变体中化合物3的结合构象与其在AfAS中的结合构象基本相同。

总结：该研究从A. fumigatiaffinis真菌中发现了一个全新的二萜环化酶AfAS，其与PaFS有着高度同源性，却产生全新四环二萜化合物1。通过同位素标记实验和DFT计算，阐明了AfAS完整的环化机制，并揭示了其独特的邻位脱质子/再质子化机制。此外，突变实验表明第65位残基可作为AfAS与PaFS功能切换的关键开关。这一发现提示我们不能仅依靠氨基酸序列的同源性来预测酶的功能，因为细微残基变化也可能对其催化活性产生重大影响。该研究加深了对萜环化酶的认知与理解，为萜类天然产物的高效挖掘提供了重要参考。

暨南大学的刘景源博士，林福龙博士，吕建明副研究员和波恩大学的Kizerbo A. Taizoumbe为本文的共同第一作者，暨南大学高昊教授、胡丹研究员和波恩大学Jeroen S. Dickschat教授为共同通讯作者。此外，暨南大学姚新生院士对该工作给予了大力支持和指导。本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省基础与应用基础研究重大项目等项目的支撑。

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