厦门大学/湖北大学，Nature Catalysis！
学术
2025-02-02 18:35
山东
血红素过氧化物酶（Haem peroxygenases）能够使用H2O2向有机分子中修饰氧原子，是受到广泛关注的生物催化剂。但是血红素过氧化酶的应用受制于使用外源性H2O2导致不可逆的氧化失活。有鉴于此，厦门大学王斌举教授、湖北大学李爱涛教授等报道血红素过氧化物酶的一种新型催化反应，这种新型催化反应使用O2和小分子还原剂（抗坏血酸、脱氢抗坏血酸（DHA））实现反应。实验和理论计算的结果表明DHAA（脱氢抗坏血酸DHA的水化物分子）是关键的共反应物分子，用于活化O2分子产生催化活性的铁氧（oxyferryl）血红素化合物I。此外，这项研究展示了这种O2/还原剂依赖性反应能够用于多种多样的血红素过氧化酶，展示了这种生物催化方法是重要的单氧酶功能。这种策略避免使用H2O2，因此避免了酶的不可逆失活问题。最后，反应能够以优异的产量大量的合成手性、高附加值产物，揭示了这种过氧化酶策略在可持续化学转化中的应用前景。图1. 血红素氧化酶的各种催化反应生成铁氧(oxyferryl)血红素化合物I（CpdI）
在各种血红素过氧化酶中，非特异性过氧化酶（UPO）能够使用H2O2作为氧化剂，向含有惰性C-H化学键的有机化学物引入氧原子（图1a）。除了UPOs之外，一些细胞色素P450s（比如CYP152过氧化酶，OleTJE、P450SPα、P450BSβ）同样是H2O2依赖性过氧化酶（图1a）。此外，除了经典P450单氧化酶需要使用氧化还原配合物以及还原剂（DAD(P)H）活化O2分子（图1b），UPOs和P450过氧化酶具有更简单的结构，能够与H2O2直接生成活性铁氧血红素化合物I（CpdI），避免了复杂的电子转移链（图1d）。虽然UPOs和P450过氧化酶是具有选择性的氧官能团化催化剂，催化反应需要加入外源性H2O2，这导致酶催化剂的不可逆氧化失活。这个问题严重限制了其在选择性氧官能团化的工业应用。图2. 体系含有小分子还原剂的rAaeUPO催化1a羟基化反应为了研究UPOs是否能够利用O2作为氧化反应的氧化剂，研究了一种研究非常广泛的rAaeUPO，以乙基苯（1a）的羟基化反应作为模型反应。向反应体系加入不同小分子还原剂（图2a,b）。测试结果表明，只有当反应体系同时具有rAaeUPO、反应物、AscA，能够生成(R)-1-苯乙醇（1b）（图2c）。为了进一步研究反应是否是O2依赖性，对无氧、有氧体系的反应情况都进行研究。研究结果表明反应在有氧条件下具有非常好的反应活性，但是在无氧条件下的反应活性非常低（图2d）。这个现象表明rAaeUPO的催化氧化反应是AscA和O2都具有依赖性。此外，通过18O2同位素标记验证了氧化产物中的氧原子来自18O2（图2e）。最后，测试了rAaeUPO酶催化剂，以1a作为反应物，在AscA存在情况的催化反应，反应生成了60 mM的产物，反应的TON达到632,100 ± 37,073（图2f）。图3. 鉴定rAaeUPO催化反应中的真实反应物DHA人们研究发现，在溶液相中，AscA能够氧化生成DHA，随后水解生成2,3-二酮-L-古洛糖酸（DKG）。此外，DHA在水中主要以水化形式存在（图3a）。作者认为DHA或者水化DHAA或者DKG有可能是反应中的真实氧化剂。因此，分别使用AscA、DHA、DKG作为还原剂，分别测试rAaeUPO催化反应的催化反应活性（起始反应速率）。测试结果表明，当体系加入DHA还原剂，起始反应速率达到144 min-1，起始反应速率比AscA快58 %。当体系加入的还原剂是DKG，反应没有产生生成。实验结果表明DHA（或DHAA）可能是UPO催化反应的真正还原剂（图3b）。之后，分别在有氧和无氧条件测试反应，发现只有在有氧条件下实现显著的催化活性，这个结果表明反应的发生同时需要DHA和O2。这项研究发现了DHA在UPO催化反应中的关键作用，当使用还原性更强的DTT时，加入10 mM DTT导致反应完全无法发生（图3d）。当使用DHA作为还原剂，加入DTT导致酶催化活性明显降低（图3e），这是因为DTT影响了DHA恢复到AscA。以上结果验证了DHA（或者DHAA）在反应中起到真正的还原剂，而不是AscA。随后，研究DHA的消耗与rAaeUPO的依赖性关系。研究结果表明，当rAaeUPO存在时，DHA的反应速率提高6倍（图3f）。对比的结果表明，AscA的消耗速率明显低于DHA（图3f）。研究实验发现，催化反应与外源性H2O2不相关（图3g）。理论计算研究。通过理论计算研究UPOs在DHA还原剂存在的催化反应机理。如图4a所示，反应物可能是水化的缩醛DHA、DHAA。DFT理论计算结果表明水化DHA生成DHAA是放热过程，表明DHA能够以水化形式在溶液相存在。如图4b所示，通过分子动力学模拟计算，发现DHAA能够稳定的结合在UPO的活性位点，但是DHAA通过E196、R189、T192之间具有氢键相互作用。这个结果表明，DHAA是UPO催化反应的还原剂。并且计算结果与实验结果相符。图5. 验证rAaeUPO催化反应中，GA和PA分子是共同反应物除了在新鲜植物组织中发现的DHA和AscA，本研究认为木质素组织中丰富的多酚化合物能够作为UPO催化氧化反应的还原剂。因此，在rAaeUPO催化1a羟基化反应中分别加入GA或PA，测试催化反应（图5a）。实验结果表明，GA和PA都能够作为共同反应物，表现优异的催化活性，起始反应速率分别达到265 min-1和141 min-1（图5b）。这个性能甚至超过了DHA作为共同反应物的催化反应速率。当加入UPO酶，显著加快GA和PA的消耗速率（图5c）。这些结果表明GA和PA是UPO催化氧化反应的还原剂。理论计算研究。通过理论计算研究多酚还原剂在UPO酶催化氧化活化O2机理。使用GA作为还原剂，发现GA与DHAA非常类似，O2与GA摘取的氢之间耦合，生成·OOH自由基并且与Fe(III)配位（图5d）（中间体2IM1′）。然后，GA自由基的OH官能团与·OOH形成氢键相互作用，产生更加稳定的中间体2IM2′。研究发现·OOH自由基容易与相邻酚自由基的OH官能团发生摘氢原子反应，生成Fe(III)-H2O2中间体。图6. UPO-过氧化酶和P450-过氧化酶分别使用不同还原剂的催化反应性能分别测试了AscA、DHA、GA、PA作为还原剂，各种血红素过氧化酶的O2/还原剂依赖性反应。结果表明，MroUPO（环己烷羟基酶，Marasmius rotula来源）、CfuCPO（苯甲硫醚的磺氧化酶，Caldariomyces fumago来源）、P450过氧化酶（月桂酸氧化酶，分别为P450SPα（Sphingomonas paucimobilis来源）、P450BSβ（Bacillus subtilis来源）、OleTJE（Jeotgalicoccussp. ATCC 8456来源）五种代表性的过氧化酶在加入还原剂之后，都表现更高的催化活性（图6a,b）。对于CfuCPO（对H2O2的容忍性更高），只有DHA和GA两种还原剂能够比H2O2-催化活性更强（图6c）。P450SPα和P450BSβ对月桂酸的羟基化反应中，各种还原剂都表现比H2O2-催化活性更高（图6c,e）。特别是，以GA和PA作为还原剂，实现了100 %的转化。在P450OleTJE催化的脱羧反应，加入还原剂后表现比H2O2-催化活性更好的效果（图6f）。这些研究结果表明，血红素过氧化酶的O2/还原剂依赖性催化反应具有广泛的兼容性，展示了优异的催化活性。比较O2/还原剂依赖性催化反应和H2O2-依赖性催化反应图7. 比较O2/还原剂-依赖性、H2O2-依赖性rAaeUPO催化体系为了进一步研究O2/还原剂依赖性比传统H2O2-依赖性路线的优势，通过光谱表征研究不同浓度的H2O2或者AscA的反应。发现rAaeUPO加入外源性H2O2，UV-Vis光谱表征的Soret峰（ferric Fe的停留态）强度逐渐降低，并且产生气泡。相比的UPO/DHAA/O2体系，生成单一Fe(III)-H2O2中间体，避免了H2O2的结合和反应。因此，UPO/DHAA/O2体系的反应能够非常好的控制Cpd I的生成以及反应物氧化，避免了血红素铁的损坏，避免酶的失活。此外，由于H2O2具有强氧化性，因此使用外源性H2O2的体系无法应用于容易H2O2氧化的反应物（图7）。研究结果表明，O2/(AscA/DHA)-依赖性催化反应能够避免使用外源性H2O2，因此适用于容易被H2O2氧化的反应物。图8. 使用AscA作为还原剂的大量反应合成高附加值产物为了展示O2/还原剂依赖性过氧化酶催化体系的工业应用前景，通过放大实验，加入还原剂制备高附加值产品（图8）。从两个反应进行验证，分别是rAaeUPO催化苄基羟基化（1a）制备(R)-1-苯乙醇（1b）、P450SPα催化4a羟基化制备α-羟基月桂酸（4b）。使用价格便宜且容易得到的AscA作为还原剂。测试rAaeUPO催化1a的羟基化反应，当200 mM 1a、40 g AscA、0.25 μM rAaeUPO的反应，能够生成9.9 g L-1的对映纯1b（(R)-1-苯乙醇）和1.8 g L-1的苯乙酮（1c），该反应的TON达到395,600，比H2O2-依赖性反应的性能（5 g L-1）更好。测试P450SPα催化4a的α-羟基化反应，当使用10 g4a，30 g AscA，1.5 μM P450SPα，反应的转化率达到>99 %，生成11.82 g α-羟基化月桂酸（4b），分离产率达到91 %，TON达到43,760，这个结果比以往报道的结果高6倍。这些放大实验结果表明使用还原剂的过氧化酶催化反应体系在制备高附加值化合物中的应用前景。这项研究展示了O2/还原剂-依赖性血红素过氧化酶催化体系的高效催化性能。在这种酶催化反应过程中，新鲜植物组织还原剂（DHA、AscA）或者木质素组织常见的多酚化合物还原剂（GA、PA）能够作为共同反应物用于催化氧化反应。对于AscA或者DHA作为还原剂的UPOs酶催化反应，通过实验和理论计算研究表明DHAA是真正活化O2分子还原剂，产生铁氧血红素（Cpd I）。在这个反应过程中，在UPO的结合口袋内通过催化反应生成Fe(III)-H2O2中间体，这个过程避免过量H2O2，因此缓解血红素催化位点的损害，避免酶的失活。使用GA和PA作为还原剂的情况与DHA和AscA不同，GA或PA还原剂在缓冲溶液产生过量H2O2（酶催化口袋外部），这在一定程度上阻碍了酶催化活性。作者发现O2/还原剂-依赖性酶催化反应过程能够用于其他血红素过氧化酶催化过程（包括UPO、CPO、CYP152）。此外，本文研究发现，AscA/DHA还原剂的体系对于容易被H2O2氧化的反应物展示了高效率和选择性氧化。总之，这些研究结果表明血红素过氧化酶能够作为单氧化酶进行催化反应，取决于环境的O2以及外部供电子体（或小分子还原剂）。这种O2-依赖性催化反应对未来的生物催化体系的发展提供启示，而且在脂肪酸的生理代谢、木质素降解、植物被致病菌感染等过程中起到作用。最后，这项研究通过扩大反应体系的量（rAaeUPO催化乙基苯的羟基化、P450SPα催化月桂酸的α-羟基化）展示了这种O2依赖性酶催化反应的实用前景。这项研究实现了优异的(R)-1-苯乙醇、α-羟基月桂酸产量（产物的量达到或超过10 g L-1）。这些产物是食品贫、化妆品、制药领域极为常见。进一步，本研究将关注于推动这些先进技术用于工业量级制备更多高附加值产品。通过先进的突变技术进化技术增强反应的立体选择性，有助于进一步提高这种催化氧化体系的功能。Deng, D., Jiang, Z., Kang, L.et al. An efficient catalytic route in haem peroxygenases mediated by O2/small-molecule reductant pairs for sustainable applications. Nat Catal 8, 20–32 (2025).
DOI: 10.1038/s41929-024-01281-7https://www.nature.com/articles/s41929-024-01281-7
