细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。对于科研狗每天到实验室第一件事就是看看自己的心肝宝贝儿“细胞”怎么样了，有没有发生污染之类的事情，就像老母亲每天睁眼看一眼孩子，发现孩子生病了一样着急，那么如何发现细胞污染呢？何种污染呢？以及在细胞层面上又有哪些小Tips呢？快来跟我一起看看吧！
微生物污染
细菌
特征：
细菌污染时细胞培养基可能呈黄色/白色浑浊
有时稍加震荡，便会有很多混浊物漂起
在显微镜下或成黑色细沙状，或背景有大量黑点
可能造成细胞增殖缓慢或型态上的改变（多角、多核等），细胞质中产生空泡、细胞不附着
真菌
酵母菌（出芽生殖）、霉菌
特征：
类似棉花絮的漂浮物可能是真菌污染
早期并不会使得培养基变浑浊，但在显微镜下可观察到菌丝体。真菌形成的菌丝呈丝状，管状、树枝状、串珠状。
若是念珠菌会呈卵圆状，在细胞周边生长
酵母菌等，当其行出芽生殖时可从一大一小的连体结构识别
细胞被污染后，仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差（一周左右）
梅雨季时的污染率会提高
支原体
革兰染色为阴性，0.15-0.3um，光学显微镜难以辨识
大部分支原体繁殖速度比细菌慢，对青霉素类的抗生素不敏感
支原体污染时细胞培养基可能依然清澈或呈微黄色
广泛存在于人和动物体内，消毒不完全的器具也易带入支原体
影响到细胞形态、增殖、基因表达蛋白合成及代谢反应
抽取核酸与蛋白可有高达30-50%为支原体来源，造成结果偏差
黑胶虫
培养基不浑浊
通常观察到小黑点在培养基中活跃游动或原地颤动，打转
黑胶虫在镜下的典型特征呈卵圆状、球状、杆状等，往往传代会出现黑胶虫污染，并且与细胞呈现此消彼长的现象；具有细胞毒性，可引起细胞生长迟缓或破解凋亡
目前科学界对黑胶虫的身份并无定论。Dr.cell目前检测的黑胶虫样本，62%为细菌，38%为支原体。
病毒
在显微镜下能明显观察到细胞碎片增多、肿大、圆缩、脱落等病态变形，可能在培养基中出现大量悬浮聚集。严重时可在细胞单层上观察到局部破损空斑
因为需种属配对才能增值，病毒污染概率相对较低
品质不好的血清、胰酶可能带有动物来源的病毒
细胞株交叉感染
不同细胞株分盘时，共享一瓶培养基
枪头、移液管忘记更换，而造成不同细胞株间的混合污染
实验操作人员误写错误的细胞株名称，例如传代时的培养皿、冻存时的冷冻小管等。
大部分的科学期刊已要求如有用到细胞做实验，均需附上“细胞鉴定报告”才可能发表文章。
细胞层面
人为选择/突变
细胞在体外培养时，实际持续经受着人为的选择，如：
胰酶消化是一种反复的人为选择过程，易消化的细胞才会被传代
过度的分化及刺激可能造成细胞异常的突变。如HeLa cell虽然还保有人的基因序列，但曾被观察到染色体数有异常增加（有观察到70-90条染色体的案例）
hES细胞株已被证实原位癌基因随着代数增加易有突变产生
应建立细胞种子库（Seed Stock）与工作库（Working Stock），并定期安排身分鉴定
老化
特征
增殖变慢、细胞异常增大或出现多核现象
不会死亡，但胞内小体变多
造成原因：
自然老化
传代时间过久
培养基失效
细胞因子刺激
细胞复苏
复苏方法：快速将细胞液化冻，离心去除上清，加入预热的培养基重悬（上清中有DMSO对细胞有毒害作用，不能长期共存）
冻存
慢冻快融
快冻时细胞内形成的冰晶对细胞有伤害
冻存方法1:将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80摄氏度过夜
冻存方法2:4度冰箱放置30min，转移至-20度放置1h（不能超过1h，冰晶对细胞伤害），最移至-80度过夜，第二天取出放入液氮罐
细胞传代
细胞的融合度过高才进行传代，会造成细胞聚集而不再是单层细胞，细胞可能会产生老化现象。重新铺盘后会容易出现细胞堆积，细胞间有空隙等情况
融合度达到80%，即可分盘
细胞与细胞之间会有黏附及通信的作用发生（Cell-Cell Adhesion and Communication ）参与细胞的识别，细胞的活化和信号转导，并且增殖时会分泌能够促进生长的生长因子形成有利于生长的环境，一旦传代密度过低会造成增殖速度迟缓或死亡。
细胞传代时，要确实的执行细胞计数，确保铺盘的密度
如果你喜欢这篇文章就点击一个大大的赞
转发给更多的小伙伴们
同时有什么想对徐琦老师说的话可以在本文留言呦❤️
添加琦哥小助理微信，即可获得电子版的“PCR相关protocol”
关注〖 医学教育徐琦 〗
微信公众号| 视频号
B站| 微博| 抖音| 小红书
徐琦老师的微店
考研视频 / 习题 / 复试指导
（听说微店商品比市面上其他渠道更便宜哦）
点击【在看】
获得徐琦老师西综加成50%Buff
