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背景介绍
上期介绍了共聚焦显微镜的技术原理，按照工作模式可以分为传统单光子共聚焦，双光子共聚焦，多光子共聚焦，本期来聊聊不同类型共焦显微镜的具体工作机理。
生物荧光染色
在生物化学领域，不同的生物分子或基团（如对DNA，蛋白质，脂类，糖类等）具有不同的吸收/辐射峰，用不同的波长照射，通过这些分子和基团对光的标记作用，就可以定性或定量分析生物组织特定化学物质的含量。荧光染色也是共聚焦显微镜的基本工作模式。荧光是分子吸收具有跃迁偶极矩的波长的能量时产生的光辐射效应。提供给基态分子的激发能将光子提升到激发单重态，然后它们衰减到该激发单重态的最低能级。该能量进一步弛豫回到分子的基态，在此过程中发射光子产生荧光，如下图所示。- 单光子激发，必然用短波长的高能光子来激发出更长波长的荧光
- 为了保证荧光的纯度，通常激发光源使用激光而非LED
- 荧光持续时间非常短，通常不超过10-8秒，所以共聚焦显微镜成像光路中，必须使用滤光片，把微弱的荧光从激发光中分离出来，从而解析组织和细胞结构。
- 实际上生物组织的自发荧光非常微弱，在生物检测中经常使用外源性的荧光造影剂（比如荧光素钠）来增加共聚焦图像的对比度。
- 为了避免激光的长时间累积对组织造成热损伤，并且为了获得更高的激发光强，通常以脉冲形式工作。
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单光子共聚焦显微镜
根据显微镜的分辨率公式可知，系统确定的前提下，观测荧光的波长越短分辨率越高。单光子共聚焦就是用前述的短波激发长波荧光标记的工作模式。为了确保荧光的波长较短，我们只能用更短的激光进行激发。![]()
但是大体趋势上来看，波长越短组织穿透性越差，共焦显微镜的目的之一是做组织深度切片观察，如果激发光穿透性不够，则显著影响显微镜的切片深度。为了兼顾显微镜的分辨率和荧光激发深度，通常波长会选择大于350nm的近紫外到可见光区间。比如下图对肿瘤细胞观测，通过不同的波长激发/辐射组合，分别得到蓝色的DNA影像，绿色的NCENP蛋白影像，红色的微管影像，通过组合图像，就可以对不同分子的排列/大小/密度/基质比率等信息来进行对比分析。![]()
双光子共聚焦显微镜
除了前述单光子激发荧光，原子或分子也能同时吸收两个光子而跃迁到高能阶的现象。在这个情况下，能阶之间的能量差正好等于吸收光子的总能。要使两个光子与分子同时反应，恰好满足能级阶跃，这样的反应机率是远小于一般的单光子吸收的，单光子吸收的反应机率和光强成正比，而双光子吸收的反应机率正比于光强的平方。由于双光子激发概率很低，需要非常高的峰值功率，我们通常使用飞秒脉冲激光器，波长通常在700nm~1100nm。
双光子吸收的讨论最早见于Maria Goeppert-Mayer于1931年提交的博士论文，但是彼时激光尚未发明，实验条件难以满足激发所需的光强，实际验证直到1960年代脉冲红宝石激光器发明后才被实现。如下图所示，共聚焦显微镜中，我们既可以用1个360nm的光子激发出460nm光子，也可以用2个720nm的光子激发出460nm的光子。
生物组织对光存在普遍的散射效应，对生物组织而言米氏散射更具一般性，而米散射强度和波长的平方成反比。![]()
在双光子中，我们可以用红外光做激发，比如波长从360nm变更到720nm，组织散射降低到25%，因而相比传统单光子共聚焦具有诸多优势：
对样品漂白染色区域小，因为只有激光焦点位置的光强才满足激发阈值。
激发光的波长更长，因而组织穿透力强，比如单光子具有50~80μm的穿透深度，而双光子可以扫描到200μm~400μm的深度范围。
- 成像的信噪比高，相比单光子组织造成的光散射显著降低，因而背景噪声很低。
双光子激发和共聚焦的结合，把共聚焦显微镜的应用推上了新的高度。双光子显微镜比单光子显微镜更适合长时间观察和研究活体细胞和组织，从而进行深层次的研究。三光子共聚焦显微镜
根据上文，我们继续往下猜想，既然有双光子吸收效应，那有没有三光子吸收效应呢？答案是肯定的。和双光子类比，三光子的激发机率和光强的立方成正比，相比双光子，我们需要进一步缩短脉冲宽度，提升脉冲峰值能量，相比双光子需要把脉冲峰值提升2个数量级。三光子成像的概念于1996年提出，目前还处于初步研究阶段。科研人员已经证实，深度脑成像的最佳激发波长在1300 nm和1700 nm左右，分别对应绿色和红色荧光团，而且由于波长更长，在探测强散射介质达成高对比度图像更有优势。因而三光子成像目前在脑科学领域发展火热。双光子激发的荧光衰减和焦点距离平方成反比，三光子激发的荧光衰减和焦点距离四次方成反比，三光子激发减少了远离焦平面区域的背景，图像信噪比提升显著。下面进行了双光子和三光子的小鼠小脑图像对比。左图是用920nm进行激发标记650μm深度的双光子小脑图像；右图是用1300nm进行激发标记650μm深度的三光子小脑图像，对比结果非常有说服力。![]()
总结
双光子是目前共聚焦显微镜最广泛的工作模式，三光子/多光子是显微镜厂商重点关注的方向。实际工作中出于研究需求，可能并不是单一模式使用，比如，我们用1300nm三光子激发出来620nm的荧光，620nm的荧光继续在双光子模式下产生次生的435nm的荧光。利用多模式配合，可以同步观测到不同的荧光基团。
思考一下
为什么共聚焦显微镜观测的生物荧光表现多以红绿可见光为主呢？
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